大孔树脂纯化藤茶黄酮及主要成分结构鉴定

1、基础研究食品科学2009, Vol. 30, No. 0951大孔树脂纯化藤茶黄酮及主要成分结构鉴定陈玉琼，李安琪，孟燕（农业部亚热带农业资源与环境重点开放实验室，华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉）摘要：选用种大孔树脂对藤茶黄酮进行了静态吸附与解吸附实验。结果表明，号树脂适宜于藤茶黄酮的分离纯化，对黄酮的吸附量可达，解析率达到。通过动态吸附实验对号树脂有关参数进行了优化。结果表明，×层析柱，黄酮加样浓度，加样体积为，流速，用的乙醇进行洗脱，可达到较好的洗脱与纯化效果，黄酮的洗脱率可达左右，洗脱出的黄酮纯度达左右。进一步利用重结晶方法得到较纯的产品，经紫外可见光谱、红外光谱、分析表明

2、，黄酮中的主要成分为二氢杨梅素。关键词：藤茶；黄酮；大孔吸附树脂；纯化；结构，（，）：，×，：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）大孔吸附树脂是世纪年代发展起来的一类吸附分离材料，由于其自身具有多孔结构，可根据空隙大小对化学成分进行机械筛分，同时又带有极性基团，可通过范德华力和形成氢键对极性相近的化学成分进行选择性吸附。黄酮类化合物多含羟基、糖苷键等极性基团，易与大孔树脂通过范德华力和氢键而被吸附，经适当溶剂（洗脱）解吸附而获得有效的分离。因此，广泛应用于黄酮类化合物的分离纯化。藤茶（），为我国特有茶用、药用植物，富含二氢杨梅素等黄酮类物质，具有收稿日期：多种保健功能。有关藤茶黄

3、酮的的纯化大多采用水提重结晶法。张友胜曾采用大孔树脂吸附杂质法来间接纯化藤茶中的二氢杨梅素。因此，藤茶黄酮的大孔树脂纯化法还有待深入研究。本实验选用种大孔树脂在静态吸附实验的基础上筛选一种适合藤茶黄酮纯化的大孔树脂。材料与方法材料与试剂藤茶粗黄酮：取一定量藤茶，按：（）加入石基金项目：农业部农业结构调整重大技术研究专项项目（）作者简介：陈玉琼（），女，副教授，博士，主要从事茶用植物功能化学功能及化学及综合利用研究。52 2009, Vol. 30, No. 09食品科学二氢杨梅素的纯化及结构鉴定基础研究油醚回流两次，每次，去石油醚，晾干后加入的含水乙醇，下回流提取，趁热抽滤，滤液于下真空浓缩，

4、冷冻干燥得粗黄酮粉。号、大孔树脂沧州宝恩化工厂；、大孔树脂天津海光化工有限公司；、大孔树脂南开大学化工厂。二氢杨梅素由实验室自制，经鉴定纯度为；甲醇（色谱纯）公司；其他试剂为国产分析纯。仪器与设备横流泵、分步收集仪上海仪器厂；旋转浓缩仪上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机美国公司；傅立叶红外分光光度计美国公司；紫外扫描仪美国；（）。方法黄酮含量测定比色法。树脂的预处理与再生用乙醇浸泡后用氢氧化钠溶液浸泡，蒸馏水洗至中性，再用盐酸溶液浸泡，用蒸馏水洗至中性。静态实验预处理后的树脂过滤后吸干表面水，称取于三角瓶中，加入浓度为的粗黄酮液，避光密封，振荡，静置后过滤，收集滤液。滤出的树脂加一定量的蒸馏水洗涤

5、，合并滤液，测滤液中黄酮含量。滤出的树脂加的乙醇浸泡后过滤，测滤液的黄酮含量，作为树脂解吸的黄酮量。原液中黄酮的量（）第一次滤出液黄酮的量（）吸附量（）树脂的重量（）解吸液中黄酮的总量（）解吸率（）×原液中黄酮的总量（）第一次滤出液黄酮的量（）经大孔树脂初步纯化的黄酮用水重结晶，重结晶的样品冷冻干燥，用于紫外、红外、分析。红外测定：压片法。条件：色谱柱：柱（×，）；流动相：乙腈：冰乙酸（：，），检测波长：；进样量，柱温，流速。条件：离子化条件：毛细管温度，喷雾器压力与流速：，；扫描范围。轰击气体为氦气，轰击能力调节在。负离子模式。结果与分析大孔树脂对藤茶黄酮的纯化大孔树脂的

6、选择用种大孔树脂预处理后，进行藤茶黄酮的静态吸附实验，测得各种树脂对黄酮的吸附与解吸结果见表。结果表明，树脂吸附黄酮效果最好，其吸附黄酮量除与、号树脂无显著差异外，显著或极显著高于其他树脂的黄酮吸附量。其次是和号树脂，每克吸附黄酮量都在以上。每种树脂对黄酮的解析结果分析表明，除、两种树脂的黄酮解析率较低外，其余种树脂对黄酮的解析效果都较好。结合树脂对藤茶黄酮的吸附与解吸附效果，选择号树脂进行动态吸附实验。表不同树脂对藤茶黄酮的吸附与解吸结果Table 1 Adsorption capabilities and desorption rates of 11 kinds ofmacroporous

7、 resins to Ampelopsis grossedentata flavones树脂号树脂对黄酮吸附量（）黄酮解吸率（）动态实验取静态吸附实验选出的树脂，预处理后湿法装入×层析柱中，蒸馏水平衡，加入定量的黄酮提取液，先用蒸馏水洗，再用相应乙醇溶液洗脱，分部收集，合并含黄酮的部分，冷冻干燥，称重，得洗脱量和洗脱率并测黄酮含量。洗脱量（）树脂对黄酮的洗脱率（）×吸附量（）注：同列不同大写字母表示在水平差异极显著；不同小写字母表示在水平差异显著。洗脱方式的确定经预处理后的号树脂湿法装柱，层析柱×，待床体平衡后，加入浓度为的粗黄酮液静置平衡，用蒸馏水以的流速洗脱至

8、检测无基础研究食品科学2009, Vol. 30, No. 0953黄酮流出。洗脱方式：依次用（）、不同浓度的乙醇洗脱，每种浓度洗至检不出黄酮为止。洗脱方式：从乙醇浓度开始洗脱；洗脱方式：从乙醇浓度开始洗脱；洗脱方式：从乙醇浓度开始洗脱，最后直接用的乙醇洗脱。收集含黄酮的洗脱液，条件下真空浓缩至少量，然后冷冻干燥，称重并测定黄酮含量。实验结果见表。表乙醇溶液不同洗脱方式藤茶黄酮洗脱率及黄酮纯度Table 2 Elution rates and purities of Ampelopsis grossedentateflavones in different ethanol elution wa

9、ys实验号黄酮洗脱效果（）洗脱率纯度洗脱率纯度洗脱率纯度洗脱率纯度洗脱率纯度洗脱用乙醇浓度（）总洗脱率（）率较低，而的洗脱流速黄酮的洗脱率也较低，说明，洗脱流速过低过高都不利于黄酮的洗脱。、的洗脱流速，黄酮洗脱率和黄酮纯度都接近，两者都可选用，在工业上可选用的流速以提高生产效率。不同加样浓度的洗脱效果表不同加样浓度洗脱黄酮效果Table 4 Effects of different concentrations of Ampelopsisgrossedentata flavones on their elution rate and purity加样浓度（）黄酮洗脱量（）黄酮洗脱率（）黄酮纯度

10、（）配制不同浓度的粗黄酮液上柱平衡，调节流速为，先用蒸馏水洗脱至检测无黄酮流出，再用的乙醇以同样的流速洗脱，收集含黄酮的洗脱液。真空浓缩后冷冻干燥，秤重，测黄酮含量。从表可以看出，随着加样浓度的增加，黄酮的洗脱量增加，洗脱、和黄酮的纯度也有增加的趋势，当达到时，黄酮的洗脱量最高，加样量为，洗脱的黄酮纯度较高，但该浓度的粗黄酮溶解较困难，因此，的加样浓度较适宜。不同加样量的洗脱效果表不同加样量黄酮洗脱结果Table 5 Effects of different sampling amounts of Ampelopsisgrossedentata flavones on their elutio

11、n rate and purity加样量（）黄酮洗脱率（）黄酮纯度（）黄酮洗脱量（）由表可见，每种方式洗脱的黄酮都主要集中在最开始用的洗脱剂的洗脱液里，以后的洗脱剂洗脱的量都很少，所以，藤茶黄酮不宜分步洗脱。洗脱用乙醇浓度对藤茶黄酮的洗脱率及洗脱黄酮的纯度影响较大。洗脱用乙醇浓度越大，黄酮的洗脱率越高，洗脱出的黄酮纯度也越高。乙醇对黄酮的洗脱率达最高。乙醇对黄酮的洗脱率略低于乙醇的洗脱率，但洗脱出的黄酮纯度较高，可达到以上。且乙醇洗脱的黄酮液浓缩干燥方便，回收溶剂容易，因此，用浓度的乙醇作洗脱液可行，也适合工业化生产。乙醇不同洗脱速度对黄酮洗脱效果的影响表乙醇不同洗脱流速洗脱藤茶黄酮的结果Ta

12、ble 3 Effects of different flow rates of 95% ethanol on elutionrate and purity of Ampelopsis grossedentata flavones流速（）黄酮洗脱率（）黄酮纯度（）配制浓度的粗黄酮液上柱，调节流速为，先用蒸馏水洗脱至检测无黄酮流出，再用的乙醇以的流速洗脱，收集含黄酮的洗脱液。真空浓缩后冷冻干燥，秤重，测黄酮含量。表表明，的加样量，黄酮的洗脱率无较大差异，加样量为时，洗脱率下降，主要是因加样量过大，随水流出的黄酮量增加。各加样量洗脱出的黄酮纯度差异不大。综合各因素，以加样量为为宜。藤茶黄酮的进一步

13、纯化与结构鉴定黄酮紫外可见光谱分析配制浓度为的粗黄酮液上柱静置平衡，调节流速，先用蒸馏水洗脱至检测无黄酮流出，再用的乙醇以同样的流速洗脱，收集含黄酮的洗脱液。真空浓缩后冷冻干燥，秤重，测黄酮含量。分析结果表明（表），洗脱流速对洗脱黄酮的纯度影响不大，但流速为、时，洗脱时间长，黄酮洗脱54 2009, Vol. 30, No. 09吸光度波长（）图黄酮及与AlCl3作用后紫外可见扫描图食品科学离子峰强度（×）基础研究图黄酮的图谱Fig.4 MS spectrogram of Ampelopsis grossedentataflavonesFig.1 UV-visible spectru

14、m of Ampelopsis grossedentata flavones-AlCl3 reaction system in methanol solution由图可知，该物质有两个吸收带，在波长处（带）有最大吸收峰，在左右（带）有一肩峰。与作用后，带吸收峰红移至处。已有分析表明，黄酮类化合物在带在波长处有强吸收，在带在波长处有肩峰往往是黄烷酮或双氢黄酮醇。这类物质与作用后，带吸收峰红移。黄酮红外光谱分析色谱图显示，在出现单一的色谱峰，说明样品较纯。经离子源轰击后分子离子化，失去一个质子，为，即原分子量为。根据已有文献报道和上述分析结果，可以基本确定该物质为二氢杨梅素。讨论大孔吸附树脂是一类

15、不含离子基团的网状结构高分子聚合物吸附剂，具有吸附性（范德华力和氢键）和分子筛（多孔性结构）的作用。大孔吸附树脂按性质分为非极性、弱极性和极性类，可根据相似相吸原理作为参考选择树脂。藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素、杨透过率（）梅素，此外，还含有少量槲皮素、山萘酚、芹菜素、花旗松素以及他们的衍生物。大多属中极性物质。本实验所选用的种大孔树脂都属极性到弱极性树脂。静态吸附实验表明，极性的树脂和对藤茶黄酮的吸附性最好，但解析率较差，因此，在生产运用中会造成原料损失严重，树脂污染也较严重，一般不宜选用。弱极性的和树脂对藤茶黄酮的解析效果虽然较好，但吸附性较差，也会造成原料的大量浪费。中极性的和号树脂吸

16、附和解吸附效果都较好，可考虑作为藤茶黄酮纯化的首选树脂。从所选的号树脂动态吸附实验分析显示，树脂对藤茶黄酮的纯化只能达到左右，黄酮要达到更高的纯度还需依赖其他的纯化手段。相关研究有待进一步深入。结论波数（）图黄酮的红外光谱图Fig.2 IR-spectrum of Ampelopsis grossedentata flavones由图可见，波数有一强吸收峰，以及有吸收峰，这是缔合的伸缩振动引起。波数的吸收峰是由引起。、为芳环振动吸收引起。推测为多羟基黄酮类物质。黄酮的图谱从种大孔树脂中筛选出的号树脂对黄酮有较高的的吸附量和解吸率，适宜于藤茶黄酮的分离，其吸附量可达，解析率达到。利用号树脂分离藤

17、茶黄酮的适宜参数为：×规格的层析柱上样浓度，加样量，的乙醇洗脱液，流速，黄酮的洗脱率可达左右，纯度达左右。经号树脂纯化的黄酮用水进一步重结晶，产品经、和分析表明为二氢杨梅素。参考文献：曹群华，瞿伟菁，李家贵，等大孔树脂吸附纯化沙棘籽渣总黄酮的时间（）图黄酮高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Ampelopsis grossedentata flavones基础研究研究中国中药杂志，（）：食品科学（）：2009, Vol. 30, No. 0955麻秀萍，蒋朝晖，杨玉琴，等大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附研究中国中药杂志，（）：何琦，及元乔，丁立生，等大孔吸附树脂银杏黄酮提取性能研究天然产物研究与开发，（）：覃洁萍，许学健，董明姣广西藤茶中黄酮类成份的提取工艺研究中国现代应用药学，（）：张友胜，杨伟丽，胡自勇增温溶解，保温过柱，温水解吸提制二氢杨梅素（