大孔吸附树脂分离纯化软枣猕猴桃总黄酮

1、工艺技术食品科学2011, Vol. 32, No. 12145大孔吸附树脂分离纯化软枣猕猴桃总黄酮刘长江，栾云峰，王 菲，梁 爽，杨智超(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)摘 要：以总黄酮吸附率、解吸率为考察指标，研究大孔吸附树脂分离纯化软枣猕猴桃总黄酮的工艺条件。结果表明：HPD600型树脂对软枣猕猴桃总黄酮有较好的吸附性能，在上样液质量浓度0.50.6mg/mL、pH34、吸附流速2mL/min、上样量3BV条件下，以3BV的水冲洗树脂柱、用4BV 80%乙醇溶液以2mL/min流速洗脱，处理后的软枣猕猴桃总黄酮平均回收率可达86.5%，平均纯度为37.2%。HPD600型

2、大孔吸附树脂适合对软枣猕猴桃黄酮进行分离纯化。关键字：大孔吸附树脂；软枣猕猴桃；总黄酮；分离纯化Macroporous Resin Adsorption for Purification of Total Flavonoids from Actinidia arguta FruitsLIU Chang-jiang，LUAN Yun-feng，WANG Fei，LIANG Shuang，YANG Zhi-Chao(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)Abstract ：

3、In the present study, macroporous resin adsorption was used to probe the purification of total flavonoids from thecrude extract of Actinidia arguta fruits, prepared by ultrasonic-assisted ethanol and reextraction with petroleum ether. Amongthe nine macroporous resins investigated, HPD 600 exhibited

4、the best performance in adsorbing and desorbing total flavonoidsfrom Actinidia arguta fruits and its optimum working parameters were sample solution pH 34, sample concentration of0.5 mg/mL, sample loading amount of 3 BV, washing water amount of 3 BV, 4 BV of 80% ethanol as the eluent at a flow rate

5、of2 mL/min. After the purification, the average recovery rate and purity of total flavonoids was 86.5% and 37.2%, respectively.Therefore, HPD600 is suitable for the purification of total flavonoids from Actinidia arguta fruits.Key words：macroporous resin；Actinidia arguta；flavonoids；purification中图分类号

6、：S663.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)12-0145-05软枣猕猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc.)，又名软枣子，猕猴梨，藤瓜，属于猕猴桃科(Actinidiaceae)、猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本植物1-2。果实多汁，可食用，酸甜适口，风味独特，其中含大量VC、B族维生素、氨基酸、类胡萝卜素等多种营养成分，具有很高的营养价值。黄酮类化合物是一类植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物3。对植物的生长、发育、开花、结果以及抵御异物

7、的侵袭起着重要作用4。研究表明，黄酮类化合物是一类具有广泛生物活性的物质，有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒，防治心血管疾病及增强人体免疫能力等多种生物活性5-8。目前，对于软枣猕猴桃的活性成分研究较少，对其中活性成分提取罕有报道。本研究采取大孔树脂分离纯化软枣猕猴桃总黄酮，对9种大孔收稿日期：2010-08-05基金项目：农业部公益性行业(农业)科研专项(200903013)树脂进行筛选，通过静态和动态实验对软枣猕猴桃总黄酮分离纯化工艺进行研究，研究结果能为软枣猕猴桃的开发利用提供一定参考。11.1材料与方法材料与试剂软枣猕猴桃 辽宁省本溪市；芦丁(化学对照品) 中国药品生物制品鉴定所；甲醇(色谱纯)

8、 北京迪马科技有限公司；其他试剂均为分析纯；大孔吸附树脂FL-1、FL-2、FL-3 天津欧瑞生物科技有限公司；大孔树脂AB-8、D101、HPD100、HPD300、HPD600、HPD700河北沧州宝恩化工有限公司。1.2仪器与设备Research移液器 德国Eppendorf公司；部分收集器 美国Waters公司；himac CR-21G型高速冷冻离心(1955)E-146 2011, Vol. 32, No. 12食品科学工艺技术机 日本日立公司；BP120S电子天平 德国Sartorius公司；TU-180型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；JY92-型超声波细胞粉碎机

9、 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-25AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；BT03DG-8型蠕动泵 天津协达伟业电子有限公司。1.31.3.1方法芦丁标准曲线提取液中黄酮质量浓度滤液中黄酮质量浓度吸附率/%=×100提取液中黄酮质量浓度1.3.4.2大孔吸附树脂的解吸率测定取1.3.4.1节中的饱和树脂，加入50mL 95%乙醇，100r/min、25恒温振荡24h，抽滤，测定滤液中的黄酮质量浓度，按下式计算各树脂的解吸率。 解吸液体积×解吸液黄酮质量浓度解吸率/%=×溶液体积×100树脂质量×吸附率采用AlCl3比色法9-10，精确称取

10、10mg芦丁标准品，以50%乙醇定容至50mL，摇匀，得0.2mg/mL芦丁溶液。分别取0、1、2、3、4、5mL芦丁标准溶液于25mL比色管，再依次加入8mL 0.1mol/L AlCl3和4mL醋酸-醋酸钠的缓冲液(pH5.5)，以50%乙醇溶液定容至25mL，静置20min，在波长415nm处测定吸光度，并以吸光度A为横坐标，以芦丁质量浓度Y(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得到回归方程：Y=0.0315A0.0002，R2=0.9999，Y为样品中黄酮质量浓度/(mg/mL)，A为测得吸光度。1.3.2黄酮粗提液的制备和总黄酮测定取软枣猕猴桃鲜果若干，匀浆，通过相应设计实验得

11、出的最佳提取工艺：乙醇体积分数71%、超声时间9min、超声功率270W，超声处理后60水浴2h，冷却后4，10000r/min离心15min，取上清液旋转蒸发浓缩至无醇味，加入适量蒸馏水用石油醚萃除去脂溶性杂质，取水相加入适量蒸馏水稀释，正丁醇萃取至无色，取正丁醇相旋转蒸发浓缩至无液体，以适量蒸馏水溶解备用。取1mL样品溶液于25mL比色管中，依次加入8mL0.1mol/L AlCl3和4mL醋酸-醋酸钠的缓冲液(pH5.5)，以50%乙醇溶液定容至25mL，静置20min，在波长415nm处测定吸光度。1.3.3大孔树脂的预处理先用水洗去树脂中的细小树脂及破碎树脂，然后乙醇浸泡24h，放出

12、浸液至洗涤液加水稀释不浑浊，水洗至无醇味，然后用5% HCl溶液浸泡3h后水洗至中性，再用2% NaOH溶液浸泡3h后水洗至中性，用蒸馏水浸泡备用11。1.3.4大孔树脂的筛选1.3.4.3大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定根据吸附率与解吸率比较，选取4种树脂进行吸附动力学测定，进一步筛选最佳树脂。准确称取处理好的树脂1.0g，用滤纸吸干表面水分，装入具塞磨口三角瓶中，加入黄酮提取液50mL，100r/min、25恒温振荡，每隔0.5h取样0.5mL，测定其中黄酮含量，计算树脂吸附量，绘制静态吸附动力学曲线。1.3.5大孔树脂的动态吸附实验由筛选实验筛选出一种理想大孔吸附树脂，进行上样流速、

13、上样液pH值、上样液质量浓度、冲洗水量、上样量、洗脱液质量浓度以及解吸液用量等进行动态吸附实验12-13。将处理好的树脂装入规格为1.5cm×20cm的玻璃层析柱中，柱床体积为20mL，将提取液以一定流速匀速上柱，每5mL收集一管流出液，当流出液吸光度达上样液1/10时，认为黄酮已透过，停止上样，计算吸附量。上样液中黄酮质量浓度洗脱液中黄酮质量浓度吸附量/(mg/g) =×溶液体积树脂质量1.3.6黄酮回收率的计算上样液黄酮质量浓度×上样液体积黄酮回收率/%=×100流出液黄酮质量浓度×流出液体积22.12.1.1结果与分析大孔树脂的筛选各种大

14、孔树脂吸附量与解吸率1.3.4.1大孔吸附树脂的吸附率测定准确称取处理好的树脂1.0g，用滤纸吸干表面水分，装入具塞磨口三角瓶中，加入粗提液50mL，100r/min、25恒温振荡24h，充分吸附后抽滤，测定滤液中黄酮质量浓度，按下式计算各树脂吸附量及吸附率12。表1各种大孔树脂对软枣猕猴桃总黄酮吸附量与解吸率Table 1 Adsorption rates and desorption rates of different types ofmacroporous resins towards total flavonoids from Actinidia arguta大孔树脂种类HPD-10

15、0HPD-300HPD-600HPD-700FL-1FL-2吸附量/(mg/g)解吸率/%2.3286.792.9088.332.9896.772.9085.002.782.08FL-32.74D-101AB-82.812.9493.5598.3651.6173.8196.43提取液中黄酮质量浓度滤液中黄酮质量浓度吸附量/(mg/g)=× 溶液体积树脂质量如表1所示，大孔树脂HPD-600、FL-3、AB-8、工艺技术食品科学100吸附率/%8060402000.00.20.42011, Vol. 32, No. 12147D-101对软枣猕猴桃总黄酮的吸附率与解吸率均明显高于其他类

16、型树脂，故选择这4种树脂通过静态吸附动力学曲线进行进一步筛选。2.1.2大孔树脂静态吸附动力学曲线0.9HPD-6000.8FL-30.7AB-80.6D-1010.50.40.30.20.00.51.01.52.02.53.03.54.05.06.0时间/h图14种大孔树脂静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetic curves of total flavonoids fromActinidia arguta on different types of macroporous resins0.60.81.0黄酮质量浓度/(mg/mL)图3上样液质量浓度对

17、吸附率的影响Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption rate of HPD-600macroporous resinA图3结果表明，在黄酮质量浓度较低时，吸附率随黄酮质量浓度上升而上升，当上样液质量浓度达到0.514mg/mL时，吸附率达到最大，随后吸附率随黄酮质量浓度上升而下降。这是由于上样液质量浓度过高，导致泄漏点提前，吸附率下降。因此，上样液质量浓度控制在0.5mg/mL左右较合适。2.2.3洗脱液质量浓度对黄酮的动态吸附的选择取软枣猕猴桃黄酮提取液50mL(0.5112mg/mL)，以1mL/min的流速上样，以1mL/mi

18、n的流速用蒸馏水洗至3BV，分别用不同体积分数的乙醇进行洗脱，计算解吸率，结果见图4。10080解吸率/%604020030405060708090100由图1可知，4种树脂对软枣猕猴桃总黄酮均属于快速平衡型，在3.5h内基本达到平衡，起始阶段吸附量都较大，但从总体上来看HPD-600和AB-8的吸附率始终明显优于另两种树脂，故选取HPD-600和AB-8进行产品纯度测定。2.22.2.1大孔树脂对黄酮的动态吸附pH值对黄酮动态吸附的影响将软枣猕猴桃黄酮提取液分别调成pH2.04、3.25、4.34、5.42、6.21、7.03、8.43、9.56，以2mL/min流速上样，按1.3.5节方法

19、进行动态吸附试验，考察pH值对吸附量的影响，结果见图2。3.53.02.52.01.51.00.50.0吸附量/(mg/g)乙醇体积分数/%图4洗脱液乙醇体积分数对解吸率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate of HPD-600macroporous resin246pH图2pH值对吸附量的影响810由图4可知，解吸率随乙醇体积分数的增加而增大，100%乙醇解吸率最大，但是效果与80%、90%乙醇相差不大，故选择80%乙醇作为洗脱液。2.2.4黄酮损失量/(mg/mL)Fig.2 Effect of pH on

20、adsorption capacity of HPD-600 macroporousresin冲洗水量对黄酮的动态吸附的影响0.160.120.080.040.00123水洗体积/BV图5冲洗杂质用水量引起的黄酮损失45图2结果表明，pH值对软枣猕猴桃总黄酮吸附量的影响比较大，在pH34时，有较大的吸附率。这是由于黄酮类化合物具有多羟基酚结构和糖苷键，呈弱酸性，因此在弱酸性或酸性条件下才能达到较好的吸附效果14。因此，上样液pH值控制在34较为合适。2.2.2上样液质量浓度对黄酮的动态吸附的影响将黄酮溶液稀释成不同质量浓度的上样液，以1mL/min的流速上样，按1.3.5节方法进行动态吸附试验

21、，考察上样液质量浓度对吸附量的影响，结果见图3。Fig.5 Effect of washing water volume on total flavonoids loss148 2011, Vol. 32, No. 12食品科学2.2.7解吸曲线工艺技术取软枣猕猴桃黄酮提取液50mL(0.5112mg/mL)，以2mL/min的流速上样，过柱完后用1BV蒸馏水冲洗，共冲洗4次，分别测定每份过柱水中总黄酮残留量并计算损失量，结果见图5。如图5所示，用蒸馏水冲洗会引起黄酮损失，当水洗体积大于3BV时，黄酮损失停止，水溶性杂质基本除去，黄酮损失量小于0.04mg/mL，故水洗体积为3BV较合适。2.

22、2.5上样流速对黄酮的动态吸附的影响取软枣猕猴桃黄酮提取液50mL(0.5112mg/mL)，以不同的流速上样，计算吸附率，结果见图6。如图6所示，吸附率随上样流速增大而降低，流速在1mL/min和2mL/min吸附率相差不大，故选择2mL/min作为上样流速。10090吸附率/%80706050123567取软枣猕猴桃黄酮提取液50mL(0.5112mg/mL)，以2mL/min的流速上样，用3BV的蒸馏水以2mL/min的流速冲，再以80%乙醇溶液以2mL/min的流速洗脱，分段收集解吸液，测定流出液中的黄酮质量浓度，结果见图8。4.03.53.02.52.01.51.00.50.0洗脱液

23、黄酮质量浓度/(mg/mL)0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0洗脱液用量/BV图8洗脱曲线Fig.8 Elution curve of total flavonoids from Actinidia arguta on HPD-600 using 90% ethanol as the eluent由图8表明，洗脱液用量小于1BV时，随洗脱液用量的增加，流出液中黄酮质量浓度不断增加；洗脱液用量继续增加，流出液中黄酮质量浓度逐渐减少；洗脱液用量达到4BV时，黄酮基本被洗净。2.3大孔吸附树脂HPD-600纯化软枣猕猴桃总黄酮回收率与纯度表2大孔吸附

24、树脂HPD-600纯化软枣猕猴桃总黄酮的回收率与纯度Table 2 Average recovery rate and purity of total flavonoids fromActinidia arguta after purification with HPD-600 macroporous resin产品纯度/%12336.237.637.937.2平均纯度/%回收率/%86.686.286.886.5平均回收率/%流速/(mL/min)图6上样流速对吸附率的影响Fig.6 Effect of sample loading flow rate on adsorption rate

25、ofHPD-600 macroporous resin2.2.6吸附透过曲线取软枣猕猴桃黄酮提取液50mL(0.5112mg/mL)，以2mL/min的流速上样，按柱床体积收集流出液，并以流出液柱床体积为横坐标，以流出液黄酮质量浓度为纵坐标绘制吸附泄露曲线，结果见图7。一般情况下流出液的目标物质量浓度达到上样液目标物质量浓度的1/10时，认为达到了目标物的泄漏点。在动态吸附过程中，药液首先与柱的上部树脂接触，并首先达到吸附饱和状态，然后这种饱和吸附状态逐渐向下推移，构成色谱带，当全部树脂吸附到一定程度，待分离开始泄漏时，停止吸附，这是达到吸附的最佳过程15。如图7所示，HPD-600型树脂对软

26、枣猕猴桃黄酮有较好的吸附性能，泄漏点为3BV左右，所以选择上样量为3BV以达到最佳吸附。0.30流出液黄酮质量0.25浓度/(mg/mL)0.200.150.100.050.001234上样量/BV图7吸附泄露曲线Fig.7 Leakage curve for the adsorption of HPD-600 macroporous resin567取黄酮粗提液50mL(0.5112mg/mL)，以2mL/min的流速进行吸附，吸附完全后，先用3BV水以2mL/min的流速冲洗树脂柱，再以4BV 80%乙醇溶液以2mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，测定黄酮含量，计算黄酮回收率，结果见表2。

27、表2表明，经大孔树脂处理后的总黄酮平均回收率为86.5%，平均纯度为37.2%，效果较好。3结论大孔吸附树脂HPD-600对软枣猕猴桃黄酮的吸附量大，易解析，产品纯度高，适合对软枣猕猴桃黄酮的纯化。结果表明，在上样液质量浓度0.5mg/mL、pH34、吸附流速2mL/min、上样量3BV条件下，以3BV水冲洗树脂柱、用4BV 80%乙醇溶液以2mL/min速率洗脱工艺技术食品科学2011, Vol. 32, No. 12149效果最佳。经处理后的软枣猕猴桃总黄酮平均回收率可达86.5%，平均纯度为37.2%。参考文献：123456赵淑兰. 软枣猕猴桃品种简介J. 特种经济动植物, 2002, 5(2): 35.刘慧涛, 张冰冰, 吕耀双. 东北地区野生猕猴桃资源现状及开发利用J. 河北林果研究, 1999(4): 327-330.吴立军. 天然药物化学M. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2