CYP2C19SOP-操作流程

1、实用标准文案海口海瑞康生物科技有限公司操作规程/细则编号：FD/PRO/0001内容：CYP2c19基因检测部门： 技术部变更版本记录：2010年第一版生效日期：批准：目的：为保证本实验室检测实验操作的标准化，确保检测结果的准确性、重复性，制定本规程精彩文档标本要求：1 .样本的收集：静脉取血1ml ,加至EDTA抗凝管中。2 .样本的贮存、运输：抗凝全血在室温保存不超过7天，2-8 C不超过1个月，-20 C不超过7周，血液样品反复冻融不超过5次。全血的运输必须遵守国家和当地有关规定。操作步骤：1基因组DNA提取1.1 处理血液材料做CYP2c19基因型检测时，只需用 200 口血液即可。当

2、血液样品体积小于200 时，可加适当体积PBS调整至200科踌进行下一步实验。1.2 活化吸附柱吸附柱在使用前需要活化，活化方法：将吸附柱置于收集管中，加入 500 谍冲液BH1 ,静 置2-3min ,12,000 rpm (9,500 x g)离心30s ;弃去收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中， 在吸附柱中加入 500 磔冲液BH2 , 12,000 rpm (9,5 00 X g)离心30s ,弃去收集管中的废液，将 吸附柱放回收集管中待用。1.3 取1.5ml离心管，做好标记，每管中加入 20科蛋白酶K溶液。1.4 加入200 口血液样品(注意：在加入血液样本之前一定要把全血

3、充分混匀)。1.5 加入200 口缓冲液BL,振荡15秒，混匀。低速离心，使管壁血液离心至底部(注意：不可将缓冲 液BL直接加入蛋白酶 K中)。1.6 56 C放置10分钟。1.7 加200科无水乙醇，振荡15秒，混匀，低速离心。1.8 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个已活化的吸附柱中（吸附柱放入收集管中），不要弄湿管口，12,000rpm （9,500 Xg）离心1min ,弃去装废液的收集管，将吸附柱插入新的收集管中。1.9 向吸附柱中加入 500 缓冲液 BW1 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500 Xg ）离心1min ,倒掉收集管中的

4、废液，将吸附柱放入收集管中。1.10 向吸附柱中加入 500 缓冲液 BW2 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500 Xg ）离心1min ,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。1.11 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm （9,500 x g）离心1min ,以彻底去除吸附材料中残余的漂洗液。1.12 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60 洗脱缓冲液BE,室温（推荐56 C）放置5min , 12,000 rpm （9,500 x g）离心1min ,将溶液收集到离心管中。2 PCR扩增试剂的分装：CYP2C1

5、9扩增?夜1 1和2）融溶后，将其分装到 0.2ml离心管中，19管。扩增产物短 时间内可于2-8 C保存。2 . 1取出原先分装好的扩增液，在管内按照如下体系配制PCR反应液，并做好标记，每人份检测使用1管CYP2C19扩增液1（19科/管）和1管CYP2c19扩增液2（19同管。3 .2取出原先分装好的扩增液，在管内按照如下体系配制PCR反应液，并做好标记。每人份检测使用1管CYP2C19扩增液1（19科/管）和1管CYP2c19扩增液2（19同管）扩增1:基因组DNACYP2c19扩增液119反应液A总体积25扩增2 :基因组DNACYP2C19扩增液219反应液A总体积252.3 将各

6、0.2ml离心管放入PCR仪中，按下列条件扩增:40sec , 72 C 30sec 35 cycles ; 72 C 5min2.4 取出扩增产物，28c保存。3杂交显色3.13.23.33.450 C 5min ; 94 C 5min ; 94 C 25sec取出BaiO ?杂交显色试剂盒。将反应液B低速离心，吸取10 口加入杂交缓冲液瓶中混匀，备用。临用前，取出1支抗体，低速离心，加入 1ml抗体稀释剂，振荡混匀，制成抗体使用液，备用，剩余试剂-20 C保存。配制杂交反应液：吸取180科杂交缓冲液，加入 10科l CYP2c19扩增产物1和10 d l CYP2c19扩增产物2,混匀。按

7、照下表要求，准备各管试剂于2ml离心管中。试管盒位置试剂名称预杂交液1200杂交反应液2008001600抗体液200400显色液2002.5 将准备好的离心管插入试管盒相应位置中。2.6 按照下表要求，设置百傲e-Hyb全自动杂交仪杂交程序。步骤反应时间反应温度（C）仪器内取样位置试管盒位置试剂名称取样次数42预杂交液23042B杂交反应液13642C洗1夜124528D洗1夜2252028E抗体液16528D洗1夜227328F洗1夜3183042G显色液19228A预杂交液21.7 取出CYP2c19基因芯片，做好标记，将基因芯片插入杂交仪插片口中，旋紧密封旋钮。注意：芯片带有“ Bai

8、O ”字样标签的一端朝外，有标签的一面朝上插入杂交仪中。1.8 将试管盒放入杂交仪中，运行杂交程序。注意：试管盒中2ml离心管对应的位置要与其相对应的芯片放入杂交仪的位置相同。如上图离心管 在试管盒中是放入第 3列（从左往右数）的，那么该芯片也要放入杂交仪中对应的第3列（从左往右数）。4 扫描4.1 杂交反应结束后，取出芯片，用蒸储水冲洗芯片表面，自然晾干。4.2 启动BE-2.0生物芯片识读仪4.3 运彳A ArrayDoctor 软件扫描器启动 1分钟后，双击计算机桌面上的 ArrayDoctor 图示，运行 ArrayDoctor 软件。显 示屏出现 ArrayDoctor 软件主页面。

9、4.4 放置芯片签面）向下拨动检测窗开启按钮，打开检测窗盖，将芯片欲扫描面（带“BaiO ”标闭合上，平整的置于检测窗的片槽内，注意，将有“BaiO ”字样标签一端朝开盖的方向。轻轻检测窗盖。4.5 图像扫描a.点击工具栏右侧的下拉列表框并选择芯片种类，在芯片种类中选择“CYP2c19基因检测试剂盒”。b.单击ArrayDoctor 软件工具栏上的“预扫描”按钮，软件自动开始预扫描并在计算机荧幕上输 出预扫描图像和一个方框。c.用鼠标左键拖动方框至要扫描的区域。d .单击ArrayDoctor 软件工具栏上的“扫描”按钮，扫描器开始扫描，并将待测图像输送至计算 机荧累。5 图像分析a.用鼠标右键单击图像，出现一网框，用鼠标左键移动网框，使每个圆点处于一个网格中。b.点击ArrayDoctor 软件工具栏上的“寻点”按钮，各圆点被选中，如果发现因为背景信号使信号点选歪（罕见），可以用鼠标移动至正确位置。c.选点完成后