SNP检测方法讲课版ppt课件

1、SNPs的检测方法 唐敏2005.8.12主要内容nSNPs的定义nSNPs的研讨意义nSNPs的研讨进展和方向nSNPs的检测方法SNPs的定义定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因组程度上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 (99.9%)SNPs的研讨意义1. SNPs作为第三代遗传标志知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_路标的作用传统研讨战略表征、蛋白、基因逆向遗传学表型、基因、蛋白，2.基因多态性研讨 研讨SNPs本身对机体的影响生理特征、病理条件下的千差万别 SNPs研讨

2、进展和方向1. SNPs数据库的构建发现2. SNPs功能的研讨在1的根底上SNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测知的SNPs(1) 灵敏度和准确度的要求反响原理严紧(2) 快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高 (3) 费用相对低廉2.现状： 到如今还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实践情况,可以选择出较适宜方法。3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。SNPs检测方法的分类一、区分一、区分SNPs 位点的位点的方法方法 1.基于杂交的方法基于杂交的方法 2.基于酶的方法

3、基于酶的方法 3.以构象为根底的方法以构象为根底的方法 4.直接测序的方法直接测序的方法二、检测分析技术二、检测分析技术 1.凝胶分析技术凝胶分析技术 2.荧光检测技术荧光检测技术 3. DNA 芯片芯片 4.质谱检测技术质谱检测技术 1.基于杂交的方法n原理:n 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进展杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。 差别越大，检测的特异性就越好1利用Tmn固定温度n 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。n 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、

4、LNAs 等n 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 核酸肽探针Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽键n特点：n1、与靶分子高特异性地结合3个方面的影响n2、链挤入 构成三链复合构造表达调控以及反义治疗方面n3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感体外运用1、与靶分子高特异性地结合nTm值高n受盐浓度影响小低盐浓度的体系nTm更大一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度n所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。 LNA(locked nucleic acids) n其构造

5、是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥。n特点：n 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合构象更利于杂交的稳定n 2.匹配和不匹配的Tm添加DASH(dynamic allele-specific hybridization2杂交+荧光共振分子信标双分子间杂交 蝎状探针分子内杂交分子信标Molecular beacons蝎状探针 Scorpion primer 2.基于酶的方法1DNA聚合酶2衔接酶3限制性内切酶4外切酶FEN5RNase H1DNA聚合酶n等位基因特异性PCRn多重等位基因特异性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸测序法等位基

6、因特异性PCRTaqman 法微测序法/引物延伸法根本步骤液相1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进展纯化去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测 放射性同位素标志法、发光检测法、凝胶为根底的荧光检测法、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等APEX (arrayed primer extension)固相焦磷酸测序法(Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶( apyrase) 。n原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进展引物延伸反响,而引物

7、的胜利延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反响,经过发光计的实时监测来到达检测的目的。根本步骤1. 1.测序引物和测序引物和DNADNA模板杂交模板杂交PCRPCR扩增的、单链的，与扩增的、单链的，与酶和底物孵育。酶和底物孵育。2.2.四种四种dNTPdNTPdATPSdATPS，dTTPdTTP，dCTPdCTP，dGTPdGTP之一被参之一被参与反响体系，如与模板配对，与引物的末端构成共价与反响体系，如与模板配对，与引物的末端构成共价键，键，dNTPdNTP的焦磷酸基团的焦磷酸基团PPiPPi释放出来。释放出来。3.3.一系列的酶学反响，发出可见光信号。每个光信号的一系列的酶学反响，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反响中掺入的核苷酸数目成正比。峰高与反响中掺入的核苷酸数目成正比。4. ATP4. ATP和未掺入的和未掺入的dNTPdNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反响体系。灭光信号，并再生反响体系。5.5.然后参与下一