大肠杆菌感受态细胞的制备和转化_第1页
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文档简介

1、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌细胞在对数生长早中期，用一定浓度的CaCl2和短时间高温（4243.5）处理，细胞易接受外源DNA，这种生理状态称为感受态。含有抗性基因的重组质粒，在大肠杆菌感受态时，可通过细胞膜上的空隙进入菌体内，保温培养一段时间，促使转化获得新的表型，在筛选培养基上培养，就可获得转化的菌落。一、大肠杆菌的培养1、大肠杆菌于37下在LB（配方附后）平板培养基中培养24h。2、挑单菌落接种到5mlLB培养液中，37震荡培养过夜（1216h）。3、取0.5ml菌液加入50mlLB培养液中，震荡23h，使光密度约为0.4OD时停止培养，装于50ml离心管中，冰水混合物上放置2

2、0min。注：培养时间不宜过长，否则细胞老化，转化率降低。1、将菌悬液以5000r/min4下离心5min，弃上清液，用灭菌滤纸吸干残液，加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl2悬液，冰浴30min。二、感受态的制备2、以5000r/min 4下离心5min，弃上清液，加入1ml预冷的含15%甘油的0.1mol/LCaCl2悬液，冰浴数分钟 。3、每个1.5ml离心管中装100 L ，冰上放置。三、大肠杆菌转化1、在感受态细胞中加入1 L 质粒DNA（带硫酸卡那霉素抗性基因），用玻璃棒轻轻混匀，并做一个不加质粒的对照。2、将离心管置于冰上30min。3、42 热激90s，不要摇动。4、冰上放置10min。5、加入1mlLB液体培养基，37 放置1h。6、以5000r/min离心4min，弃上清液，加入200 L培养液悬浮沉淀。7、悬浮物均匀涂布于含50200mg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。8、37 培养24h，观察在抗性培养基上生长的菌落。培养基上长出的菌落是已经转化的大肠杆菌菌落LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L，pH调至7.0，高压灭菌

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