第5章 目的基因制取

1、第五章第五章 目的基因制取目的基因制取在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下，基因在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下，基因的制备方法主要可分为两大类：的制备方法主要可分为两大类：u 化学合成法化学合成法u 生物制备法生物制备法 基因文库法、基因文库法、 cDNA cDNA 文库法文库法 PCRPCR法等。法等。 就化学本质而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷就化学本质而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子结构，就可以进行基因的化酸序列。如果知道了基因的分子结构，就可以进行基因的化学合成。学合成。 有关有关DNA 的化学合成方法主要有的化学合

2、成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及固相亚磷酸酰胺法法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及固相亚磷酸酰胺法。磷。磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷酸酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分酰胺法是目前绝大部分DNA 自动合成仪所使用的方法。由于自动合成仪所使用的方法。由于现代科学技术的发展，现代科学技术的发展，DNA 的化学合成已经广泛采用的化学合成已经广泛采用DNA 自自动合成仪进行。动合成仪进行。1. 化学合成法化学合成法 基因的化学合成法主要用于基因的化学合成法主要用于PCR扩增引物、核酸测序引物

3、、扩增引物、核酸测序引物、核酸杂交探针和合成人工接头等核苷酸片段的合成核酸杂交探针和合成人工接头等核苷酸片段的合成,随着合成随着合成生物学的发展，近来也用于全基因合成。生物学的发展，近来也用于全基因合成。 1.1 磷酸二酯法磷酸二酯法将二个分别在将二个分别在5-或或3-末末端带有适当保护基的脱端带有适当保护基的脱氧单核苷酸连接起来，氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸键的脱氧二核苷酸 将脱氧二核苷酸将脱氧二核苷酸5-或或3-末端脱保护，与另一个末端脱保护，与另一个3-或或5-末端脱保护的脱末端脱保护的脱氧二核苷酸氧二核苷酸 进行第二次进行第二次缩合缩合依

4、次进行循环，直至合依次进行循环，直至合成全长的成全长的DNA分子分子A1.2 固相亚磷酰胺法固相亚磷酰胺法原理：将所要合成的寡聚核苷酸链的原理：将所要合成的寡聚核苷酸链的3-末端先与一个不溶性末端先与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从）连接，然后依次从3-5的方向的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程：是经过保护的，具体的合成和延伸过程：n脱去脱去CPG载体上第一个核苷酸的载体上第一个核苷酸的5端保护基（端保护基（DMTrO)n第二个核苷酸第二个核苷

5、酸5端被端被DMTrO保护，保护，3端被亚磷酰胺保护，随端被亚磷酰胺保护，随后后3端被四氮唑活化剂活化，和第一个核苷酸发生缩合，脱端被四氮唑活化剂活化，和第一个核苷酸发生缩合，脱去四唑基团。去四唑基团。n没有参与缩合反应的第一个核苷酸的没有参与缩合反应的第一个核苷酸的5端被乙酰化封闭端被乙酰化封闭n脱氧核苷酸二聚体的脱氧核苷酸二聚体的3价磷被碘氧化成价磷被碘氧化成5价磷，形成稳定的二价磷，形成稳定的二聚体。聚体。n二聚体二聚体5端脱端脱DMTrO，加入第三个被活化的核苷酸，进行循环。加入第三个被活化的核苷酸，进行循环。便于自动化操作，通过计算机控制进行基因合成便于自动化操作，通过计算机控制进行

6、基因合成DMTrO:DMTrO:二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基三氯乙酸亚磷酸三酯磷酸三酯循环合成结束后脱去循环合成结束后脱去P P上连的保护基团，并与固相载体脱离，进一步纯化上连的保护基团，并与固相载体脱离，进一步纯化化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150200bp，而，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。适当连接组装成完整的基因。方法方法1是先将寡聚核苷酸激活，带上必要的是先将寡聚核苷酸激活，带上必要的5-磷酸基团，磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片

7、段退火，形成带有粘性末端的然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。个完整的基团或基团的一个大片段。方法方法2是将两条具有互补是将两条具有互补3末端的长的寡核苷酸片段彼此末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。片段，可经处理插入适当的载

8、体上。 其它方法：多片段重叠延伸其它方法：多片段重叠延伸PCR u序列已知；序列已知；u化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基片段长度有限，经基因组装才能合成较大因组装才能合成较大的目的基因，而这往的目的基因，而这往往使基因制备难度加往使基因制备难度加大；大；u化学基因合成比较昂化学基因合成比较昂贵。（约贵。（约3 3元元/bp)/bp) 1.3 1.3 基因芯片法基因芯片法成本可降到成本可降到0.010.01美元美元/bp/bp限制化学法合成基因的限制化学法合成基因的因素：因素：、DNA Array Manufacturing ProcessVery Large-Scale

9、Immobilized Polymer Synthesis (VLSIPS)Treat substrate with chemically protected linker moleculesSelectively expose array sites to lightFlush chips surface with solution of protected A, C, G, TRepeat last two steps until desired probes are synthesized照相平板印刷技术Probe Synthesisarray probesA 33 arrayCGACG

10、ACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAAProbe Synthesisarray probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAAProbe Synthesisarray probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGG2. 基因组文库法基因组文库法基因组文库法

11、基因组文库法是一种直接从基是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。因组中分离目的基因的方法。基因组文库基因组文库（gene library或或gene bank），是指汇集某一），是指汇集某一基因组所有基因组所有DNA 序列的重组序列的重组DNA 群体。群体。高等真核生物染色体基因组文高等真核生物染色体基因组文库通常是以库通常是以噬菌体作为载体噬菌体作为载体构建的，有时也可以柯斯质粒构建的，有时也可以柯斯质粒作为载体构建。作为载体构建。通常基因组通常基因组DNA被超声波或内切酶被超声波或内切酶处理成随机处理成大小不同的片段，处理成随机处理成大小不同的片段，这些片段和载体连接后制备成基因这些片段

12、和载体连接后制备成基因组文库，用于测序、拼装。也称为组文库，用于测序、拼装。也称为“鸟枪法鸟枪法”。2.1 基因文库的大小基因文库的大小一个基因组文库要包含一个基因组文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数时所需要的克隆数目：目：N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组片断的平均长度占整个基因组DNA的的百分数百分数, 其倒数为最低克隆数其倒数为最低克隆数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）,一般为最低克隆数的一般为最低克隆数的5

13、10倍倍影响因素：基因组规模、载体容量影响因素：基因组规模、载体容量利用利用噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下： 选用识别序列均为选用识别序列均为4个核苷酸的两种限制性内切核酸酶，对个核苷酸的两种限制性内切核酸酶，对从某一高等真核生物组织细胞中从某一高等真核生物组织细胞中提取的染色体基因组提取的染色体基因组DNA 进进行行部分酶解部分酶解，得到，得到1030 kb的的 DNA 限制性片段，利用凝胶电限制性片段，利用凝胶电泳法等从中泳法等从中分离分离出大小为出大小为 20 kb左右的随机片段群体左右的随机片段群体 选用适当的限制性内切核酸酶酶解

14、选用适当的限制性内切核酸酶酶解噬菌体载体噬菌体载体DNA 。 经适当处理，将基因组经适当处理，将基因组DNA 限制性片段与限制性片段与噬菌体载体进噬菌体载体进行行体外重组体外重组。 利用体外包装系统将重组体利用体外包装系统将重组体包装包装成完整的颗粒。成完整的颗粒。 以重组噬菌体颗粒以重组噬菌体颗粒侵染侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个形成含有整个DNA 的重组的重组DNA 群体，即文库。群体，即文库。2.2 2.2 基因组文库构建过程基因组文库构建过程具备了文库，就可以适当的目的基因片段作探针，利用高密具备了文库，就可以适当的目的基因片段作探针，利用

15、高密度的噬菌斑或菌落度的噬菌斑或菌落原位杂交原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增提取提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。对于某些营养物质的合成基因的分离，可以将文库转化该营对于某些营养物质的合成基因的分离，可以将文库转化该营养的缺陷型菌株，在基本培养基中进行筛选。养的缺陷型菌株，在基本培养基中进行筛选。高等真核生物基因组高等真核生物基因组DNA DNA 文库比其文库比其cDNA cDNA 文库大得多，

16、相关工文库大得多，相关工作量同样大得多。作量同样大得多。在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，大肠杆在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物能表达真核生物DNA DNA 。而在真核生物成熟。而在真核生物成熟mRNA mRNA 中已不存在间中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），以真核生物成熟隔序列（已在拼接过程中被去除），以真核生物成熟mRNA mRNA 为为模板，逆转录而成的模板，逆转录而成的cDNA cDNA 可被大肠杆菌表达。可被大肠杆菌表达。因此

17、，在基因工程中，因此，在基因工程中，cDNA cDNA 文库法是从真核生物细胞中分离文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。目的基因的常用方法。3 cDNA 文库法文库法cDNA 文库文库:是指汇集以某生物成熟是指汇集以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而成为模板逆转录而成的的cDNA 序列的重组序列的重组DNA 群体。群体。N=ln (1-p)ln (1-1/n)一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数时所需要的克隆数目：目：1/n：每种低丰度：每种低丰度mRNA分子占总分子占总mRNA分子的比值分子的比值低丰度：不多于低丰度：不多于14个拷贝个

18、拷贝/细胞，对于真核细胞，占总细胞，对于真核细胞，占总mRNA质量的质量的30%，约，约11000种。种。则则1/n=30%（1/11000)， n为最低克隆数为最低克隆数3.1 cDNA文库的大小文库的大小3.2 cDNA基因文库的构建过程基因文库的构建过程l总总RNA（total RNA）提取）提取lmRNA分离纯化分离纯化l逆转录逆转录l克隆克隆l筛选筛选 总总RNA提取：提取：u 胍盐胍盐-氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法u 酸性胍酸性胍-酚氯仿抽提法酚氯仿抽提法 u Trizol法（异硫氰酸胍法（异硫氰酸胍+苯酚）苯酚） Trizol 处理、氯仿抽提、收集水相、异丙醇沉淀处理

19、、氯仿抽提、收集水相、异丙醇沉淀异硫氰酸胍异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的变性解离，使可裂解细胞，促使核蛋白体的变性解离，使RNA与与蛋白质分离，并将蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。（也破坏释放到溶液中。（也破坏RNase）酸性苯酚酸性苯酚可促使可促使RNA进入水相进入水相氯仿氯仿可抽提酸性的苯酚，离心后可形成水相层和有机层，这样可抽提酸性的苯酚，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无分离开。水相层（无色）主要为色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。和蛋白质。u 硅胶膜特异

20、性吸附的离心柱提取法硅胶膜特异性吸附的离心柱提取法 采用一系列裂解液裂解组织、细胞，抑制采用一系列裂解液裂解组织、细胞，抑制RNARNA酶，释放酶，释放RNARNA，调节结合条件之后，硅胶膜特异性吸附，调节结合条件之后，硅胶膜特异性吸附RNARNA，多次漂洗，多次漂洗去除去除DNADNA、蛋白质及其他杂质，最后经低盐溶液洗脱、蛋白质及其他杂质，最后经低盐溶液洗脱RNARNA 在高盐（如在高盐（如3-5M盐酸胍）低盐酸胍）低PH值（值（5.0-6.5）状态下，）状态下，硅胶膜专一性地吸附硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐（；而在低盐（TE或者或者2.5mM Tris-HCL）或水溶液状态下，）或

21、水溶液状态下，DNA被洗脱下来被洗脱下来 注意事项：注意事项：u RNase酶在环境中普遍存在，要严格防止污染：酶在环境中普遍存在，要严格防止污染：u全程需戴手套操作全程需戴手套操作u玻璃器皿玻璃器皿200处理处理2小时以上小时以上u不耐高温物品（枪头、离心管等）用不耐高温物品（枪头、离心管等）用DEPC（0.1%焦碳酸焦碳酸二乙酯）浸泡处理，然后冲净或煮沸去除二乙酯）浸泡处理，然后冲净或煮沸去除DEPC。（包括（包括试剂）试剂）u破碎细胞需使用强变性剂：胍、酚等破碎细胞需使用强变性剂：胍、酚等RNA流经利用流经利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从总从总RNA（

22、rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。 mRNA的分离纯化的分离纯化纤维素柱层析法原理：纤维素柱层析法原理：当当RNA流经流经oligo (dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的。纯化的mRNA在在70%乙醇中乙醇中-70可保存一

23、年以上可保存一年以上原核细胞原核细胞mRNA分纯分纯u polyA加尾，酿酒酵母的加尾，酿酒酵母的polyA多聚酶可以特异性的对多聚酶可以特异性的对mRNA加尾，而对加尾，而对sRNA无法加尾无法加尾u 逆转录逆转录23/16sRNA, 加入加入RNase， DNaseI处理杂交链，处理杂交链， 23/16sRNA及及DNA均被破坏，过柱富集均被破坏，过柱富集mRNA分子分子磁珠法原理：磁珠法原理： 生物素标记生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与与mRNA

24、的的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无最后用无RNase去离子水将去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即从复合物中洗脱下来即 逆转录逆转录l自身引导法（自身引导法（S1S1核酸酶降解法）核酸酶降解法） l置换合成法（置换合成法（RNaseHRNaseH处理）处理）cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链53mRNAcDNA第一链第一链35mRNAmRNADNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第

25、一链35DNA ligase去引物去引物AMV : AMV : 鸟类成髓细胞白血病病毒的逆转录酶鸟类成髓细胞白血病病毒的逆转录酶MLV : MLV : 莫洛尼鼠的白血病病毒的逆转录酶莫洛尼鼠的白血病病毒的逆转录酶l随机引物法随机引物法 6聚核苷酸随机引物引发聚核苷酸随机引物引发cDNA第二链合成第二链合成l末端转移法（同聚物引导法）末端转移法（同聚物引导法） 利用末端转移酶在利用末端转移酶在cDNA第一链第一链3端加同聚核苷酸尾端加同聚核苷酸尾巴（如多聚巴（如多聚G），以多聚），以多聚C为引物合成第二链（在多聚为引物合成第二链（在多聚C的的5端可以加入酶切位点，利于后续克隆操作）。端可以加入酶

26、切位点，利于后续克隆操作）。克隆筛选方法克隆筛选方法 ：同基因组文库：同基因组文库缺点：缺点： 由于克隆过程经多步分离、纯化，低丰度由于克隆过程经多步分离、纯化，低丰度cDNA可能损可能损失，被克隆的几率很小失，被克隆的几率很小（借助（借助PCR解决，解决，P177图）图） mRNA容易被部分降解，很难得到全长容易被部分降解，很难得到全长cDNA.（合成（合成全长全长cDNA)3.3 全长全长cDNA文库的构建及文库的构建及cDNA克隆克隆（1）RACE (rapid-amplification of cDNA ends)是基于是基于PCR技术技术由已知的一段由已知的一段cDNA序列序列,通过

27、往两端延伸扩增从而获得完整的通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和端和5端的方法端的方法.又被称为又被称为锚定锚定 PCR (anchored PCR)和和单边单边PCR (one side PCR)。 PCR全长序列全长序列u以以oligo(dT)l7和一个和一个35bp的接的接头头(dT17-adaptor,锚定引物锚定引物)为为引物进行反转录，接头序列中引物进行反转录，接头序列中稀有限制酶稀有限制酶的酶切位点。这样的酶切位点。这样就在未知就在未知cDNA的的3末端接上末端接上了一段特殊的接头序列。了一段特殊的接头序列。u利用已知的部分利用已知的部分cDNA 序列设序列设计计基因特异引物基

28、因特异引物GSP，它，它)与与少量少量(-)cDNA退火并延伸，产退火并延伸，产生互补的第二链生互补的第二链(+)cDNA。u利用利用GSP和接头引物进行和接头引物进行PCR循环即可扩增得到循环即可扩增得到cDNA双链。双链。扩增的特异性取决于特异引物扩增的特异性取决于特异引物与目标与目标cDNA分子互补能分子互补能力而用接头引物来取代力而用接头引物来取代dT17一一adaptor则可阻止长则可阻止长(dT)碱基引起的错配。碱基引起的错配。u可设计嵌套引物进行可设计嵌套引物进行PCR扩增，扩增，以提高低丰度以提高低丰度cDNA扩增的特扩增的特异性异性（见（见P179 图）图）GSP : gen

29、e specific primerGSP3RACEu设计了一个用于逆转录的基设计了一个用于逆转录的基因特异引物因特异引物GSP-RT，进行，进行逆转录，合成（逆转录，合成（-）cDNA。u用用RNase降解降解RNA，然后用，然后用末端转移酶在（末端转移酶在（-）cDNA的的3端加端加poly(A或或C)尾尾u再用锚定引物合成第二链再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,u接下来与接下来与3 RACE过程相同。过程相同。用接头引物和位于延伸引物用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物上游的基因特异性引物GSP进行进行PCR扩增。扩增。 5RACECIAP(CIAP(牛小肠磷酸酶牛小肠磷酸酶)

30、 )除去除去5 5磷酸，非全长磷酸，非全长mRNAmRNA的的5 5端无法进行连接，而全长端无法进行连接，而全长分子有分子有5 5-cap-cap的保护的保护TAPTAP（烟草酸焦磷酸酶）（烟草酸焦磷酸酶）去除去除5 5-cap-cap，加入锚定引物，在，加入锚定引物，在RNARNA连接酶连接酶作用下作用下将其连在全长将其连在全长mRNA 5mRNA 5端端嵌套嵌套PCRPCR进行进行5 5 RACE RACE连接酶介导的连接酶介导的RACEu通常的克隆方法是同时使用一个切点位于通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶接头序列上的限制性内切酶和和一个切点位于扩增区域内的内切

31、酶一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的。由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆从而增加产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆从而增加了克隆的选择效率。了克隆的选择效率。u也可在基因特异性引物的也可在基因特异性引物的 5端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3和和5RACE产物中获得全长产物中获得全长cDNA。u最后通过分析最后通过分析RACE产物的产物的3和和5端序列，合成相应引物来扩增端序列，合成相应引物

32、来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长的反转录产物，从而获得全长cDNA。 优点：优点：无需提纯无需提纯mRNA,可直接从总可直接从总RNA中得到目的基因全长序列中得到目的基因全长序列,无需做克隆文库无需做克隆文库，只需做只需做5端目的产物和端目的产物和3端目的产物的亚克隆端目的产物的亚克隆缺点：缺点：5端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉,特别是由于有大的转特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结构时录物或者存在复杂的二级结构时 连接反应通常效率很低连接反应通常效率很低, 不能保证不能保证PCR的高成功率的高成功率经常出现非特异性扩增产

33、物经常出现非特异性扩增产物 （2）载体引物法）载体引物法 RNA经经CIAP,TAP,RNA连接酶处理连上连接酶处理连上5端锚定引物后，加入端锚定引物后，加入具有多聚具有多聚T尾巴的载体引物（即整个载体作为衔接体）尾巴的载体引物（即整个载体作为衔接体） 反转录后用反转录后用5端锚定引物合成第二链，直接酶切处理进行自连端锚定引物合成第二链，直接酶切处理进行自连接，转化宿主细胞得到全长接，转化宿主细胞得到全长cDNA文库。文库。P183 图图（3）固相支持物法）固相支持物法 高碘酸钠处理高碘酸钠处理5cap后，可以在后，可以在5cap接上生物素，因此全接上生物素，因此全长长mRNA全部有生物素标记

34、全部有生物素标记 逆转录后用逆转录后用RNaseI水解单链核酸（水解单链核酸（RNA-DNA杂交双链不杂交双链不被水解）被水解） 用亲和素包裹的磁性珠作为固相支持物，结合杂交链用亲和素包裹的磁性珠作为固相支持物，结合杂交链 ，得，得到全长到全长cDNA第一链第一链 184 图图8.18(4).SMART技术技术SMART (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)，模板转，模板转换机制换机制原理：原理： 逆转录酶逆转录酶以以mRNA为模板合成为模板合成cDNA，在到达，在到达mRNA的的5 帽子帽子时会在时会在cDNA3末端加上几个

35、末端加上几个C，在逆转录时加入，在逆转录时加入3末端带末端带Oligo（dG）的）的SMART引物引物，它与合成，它与合成cDNA末端突出的几个末端突出的几个C配对后配对后形成形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板自动转换模板，以，以SMART引引物作为延伸模板继续延伸物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到单链直到引物的末端，这样得到的所有的所有cDNA单链的一端有含单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一）的起始引物序列，另一端有已知的端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物引物序列，合成第二链后可以利用通用引物

36、进行扩增。由于只有进行扩增。由于只有5帽子结构的帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到才能利用这个反应得到能扩增的能扩增的cDNA，因此扩增得到的，因此扩增得到的cDNA就是全长就是全长cDNA。 capcapPoly CPoly G利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至反应，只需要少至25ng的的mRNA或者或者50ng的的Total RNA就可以就可以得到高质量、高产量的得到高质量、高产量的cDNA库，更重

37、要的是得到的库，更重要的是得到的cDNA能能够代表原有样品中的够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以的丰度，可以应用于直接扩增基应用于直接扩增基因、构建因、构建cDNA文库、已知序列钓全长文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和），和用于芯片检测的用于芯片检测的cDNA探针的扩增探针的扩增等。等。 3.4 差示文库和消减文库差示文库和消减文库（1）mRNA差别显示差别显示mRNA差别显示技术也称为差示反转录差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为简称为ddRT-PCR。它是将它是将mR

38、NA反转反转录技术与录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱指纹图谱技术，广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。技术，广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。 差别基因表达差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。一种快速而行之有效的方法。 基本原理基本原理：提取总：提取总RNA进行反转录，引物为进行反转录，引物为Oligo（dT12） MN，其中，其中M

39、称为锚定碱基，为称为锚定碱基，为A，C，G中的任意一种。中的任意一种。N称为分类碱基，为称为分类碱基，为A，C，G或或T中的任意一种，共有中的任意一种，共有12种种 MN引物，用这引物，用这12种引物分别对同一总种引物分别对同一总RNA样品进行进行样品进行进行12次不同的反转录反应，从而使次不同的反转录反应，从而使反转录的反转录的cDNA具有具有12种类种类型型，也就是对，也就是对cDNA进行进行12种归类。在此基础上用种归类。在此基础上用随机引物和反转录引物随机引物和反转录引物对每一类对每一类cDNA进行进行PCR扩增扩增，然后进行凝胶电泳分析，从而确定不同样，然后进行凝胶电泳分析，从而确定

40、不同样品间基因在时间和空间上特异性的表达。品间基因在时间和空间上特异性的表达。优点：优点：u简单、快速、简单、快速、可检测表达的可检测表达的所有基因所有基因(包括低丰度），需包括低丰度），需要的总要的总RNA量少；量少；u同时检测基因的上、下调表同时检测基因的上、下调表达、展现所有差异、比较多达、展现所有差异、比较多种细胞类型；种细胞类型；缺点：缺点：u检测全部检测全部mRNA的的PCR工作工作量很大；量很大；uPAGE分离的分离的cDNA大于大于500bp时会漏检，时会漏检，u出现差别条带太多，假阳性出现差别条带太多，假阳性率高达率高达70%左右左右u一般得到一般得到mRNA 3端非翻译端非

41、翻译区序列区序列u不同条带有可能重合不同条带有可能重合（2）差别杂交法与差示文库）差别杂交法与差示文库差别杂交差别杂交：分别制备两种细胞群体的分别制备两种细胞群体的mRNA提取物，其中一提取物，其中一个群体含有目的基因个群体含有目的基因mRNA，另一个群体不含。分别反转录，另一个群体不含。分别反转录制备总制备总mRNA的的cDNA探针，两类探针分别与表达目的基因的探针，两类探针分别与表达目的基因的细胞群体构建的细胞群体构建的c DNA克隆文库克隆文库杂交，从而筛选到含有目的基杂交，从而筛选到含有目的基因的克隆。因的克隆。 缺点：缺点：u由于差别杂交中所使用的杂交探针是由于差别杂交中所使用的杂交

42、探针是mRNA 反转录成的反转录成的cDNA 群体，真群体，真正能与目的基因核苷酸序列完全互补的探针仅占很低的比例，以至于那正能与目的基因核苷酸序列完全互补的探针仅占很低的比例，以至于那些低丰度的些低丰度的mRNA 的的cDNA 克隆很难用此法检测出来。克隆很难用此法检测出来。u其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。u两套平行转移的滤膜之间，两套平行转移的滤膜之间，DNA 的保有量往往是有差别的，这样所得的保有量往往是有差别的，这样所得的

43、杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的的杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。阳性鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。 差别杂交法差别杂交法（3）消减杂交法）消减杂交法 克隆，克隆，称为消减文库称为消减文库T细胞 B 细胞用固相支持物法、用固相支持物法、SMART等方法制等方法制备全长备全长cDNAcDNA长度长度可能不全可能不全cDNA丰度过低丰度过低PCR扩增后构建扩增后构建文库文库（4）代表性差异显示（）代表性差异显示（RAD)代表性差示分析代表性差示分析( (repr

44、esential display analysis) ：充分发挥了：充分发挥了PCRPCR以以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过通过消减消减和和富集富集，使得差异基因片段得到特异性扩增。，使得差异基因片段得到特异性扩增。 u将待测将待测cDNA （Tester）和驱离）和驱离cDNA （Driver）分别用同一种识别）分别用同一种识别4碱基碱基序列的限制性内切酶切割形成的平均长度为序列的限制性内切酶切割形成的平均长度为256 bp的的cDNA 片段片段u分别分别接上寡聚核苷酸接头接上寡聚核苷酸接头（adaptor），

45、并以接头为引物进行），并以接头为引物进行PCR扩增扩增u将将接头切除接头切除，并只在，并只在Tester片断末端片断末端接上新接头接上新接头，然后将，然后将Tester与大大过与大大过量的量的Driver混合杂交混合杂交。Driver过量的目的是使群体中特异性序列没有遗过量的目的是使群体中特异性序列没有遗漏的可能；漏的可能；u复性，补平末端，并以新接头为引物进行复性，补平末端，并以新接头为引物进行PCR扩增扩增，形成的，形成的3种杂交体中种杂交体中只有自身退火形成的只有自身退火形成的Tester/Tester两端均能和引物配对，产物呈指数递增。两端均能和引物配对，产物呈指数递增。Tester/

46、Driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链杂交体只能是单引物扩增，产物为单链DNA 分子，其数量分子，其数量呈线性递增。呈线性递增。Driver/ Driver杂交体由于分子两端没有与新引物配对区而杂交体由于分子两端没有与新引物配对区而无法进行扩增；无法进行扩增；u用用Mung Bean Nuclease去除单链去除单链DNA 分子，差异双链分子，差异双链cDNA 便完成第一便完成第一轮富集。轮富集。重复第重复第2、3轮富集轮富集。 （P193图）图）优点：优点：n可重复性好；可重复性好；n假阳性少；假阳性少；nmRNA 用量少、特异性高。用量少、特异性高。缺点：缺点：nTester组低丰

47、度的分子自身杂交的几率很低组低丰度的分子自身杂交的几率很低(混合体系中有混合体系中有10%的单链分子），所以被扩增的几率仍很低；的单链分子），所以被扩增的几率仍很低；n酶切连接步骤太多，酶切连接步骤太多，cDNA 会损失很多，所以可能漏掉关会损失很多，所以可能漏掉关键基因；键基因；n得到的不是得到的不是cDNA 全长而是其酶切片段。全长而是其酶切片段。 实验中使用过量实验中使用过量Driver DNA 目的是充分使目的是充分使Tester DNA 中与中与Driver DNA 序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链cDNA 经经PCR几轮循环得以有

48、效富集。几轮循环得以有效富集。（5）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（SSH）1996年建立了在抑制年建立了在抑制PCR与消减杂交技术上的差异基因检测方与消减杂交技术上的差异基因检测方法法抑制性消减（扣除）杂交（抑制性消减（扣除）杂交（SSH， suppression subtractive hybridization）。该方法运用了杂交二级动力学原理：即丰度高的单链该方法运用了杂交二级动力学原理：即丰度高的单链cDNA 在退在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA ，从而使原来在，从而使原来在丰度上有差别的单链丰度上有差别的单链cDNA 相对含量达

49、到基本一致。相对含量达到基本一致。而所谓而所谓抑制抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。段的扩增。 u与与RAD相同，相同，酶切后酶切后得到得到Tester与与Driver样本的样本的cDNA 片段，将片段，将Tester cDNA 均分两份，分别均分两份，分别接上接头接上接头1和接头和接头2。u用过量的用过量的Driver样品分别与两份样品分别与两份Tester样品进行第一次样品进行第一次不充分消减杂交不充分消减杂交，浓度高的单链分子迅速复性，大部分形成异源双链，而浓度低的单链分浓度高的单链分子迅速复性，大部分形成异源双链，而浓度低的单链分子仍以单链形