果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素

1、LOGO果实特异性果实特异性RNAi介导的介导的Lcy基因沉默基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量来增加番茄中番茄红素的含量Company Logo主要内容主要内容背景知识介绍背景知识介绍1实验的目的及意义实验的目的及意义2实验材料和方法实验材料和方法3实验结果实验结果4 讨论讨论5Company Logo1.背景知识介绍背景知识介绍v RNAi(RNA interference)是一种基因阻是一种基因阻断技术，断技术，它通过人为地引入与内源靶基因具有它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链相同序列的双链RNA(有义有义RNA和反义和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的从而诱导内源靶基因的m

2、RNA降解，达到阻降解，达到阻止基因表达的目的。止基因表达的目的。植物的转基因研究表明：导入含有内含子的能转录植物的转基因研究表明：导入含有内含子的能转录成双链成双链RNA的的DNA片段的反向重复序列能实现特异片段的反向重复序列能实现特异基因的完全沉默。基因的完全沉默。Company LogoRNAi的发现的发现90 年，美国学者年，美国学者 JORGENSEN 等等研究矮牵牛花研究矮牵牛花紫色色素合成紫色色素合成 酶基因导入后酶基因导入后Company LogoRNAi的发现的发现1995 年年1998 年年 1992年年 ROMANO 和和 MACINO在脉孢霉在脉孢霉进行转基因研究时进行

3、转基因研究时， 发现存在于真菌发现存在于真菌中的类似现象，他中的类似现象，他们称之为基因抑制们称之为基因抑制(quelling) 。GUO 等在以等在以 反反 义义 RNA 技技 术术 研研 究究 秀秀 丽丽 新新 杆杆 线线 虫虫 par-1 基因的功能基因的功能时意外地发现时意外地发现, 反反义义RNA没有抑制该没有抑制该基因而正义基因而正义RNA增增强该基因表达。强该基因表达。FIRE 和和 MELLO将正反义链构成的将正反义链构成的双链双链RNA 纯化后纯化后注射给线虫注射给线虫, 能高能高效特异地阻断相应效特异地阻断相应基因的表达基因的表达, 他们他们称此现象为称此现象为 RNAi。

4、mRNA 是双链是双链 RNA 的靶目的靶目标标,mRNA 在翻译之前就被降解在翻译之前就被降解, 双链双链 RNA 是在转录后发挥作用是在转录后发挥作用Company Logov Dicer is a member of the RNase III family of nucleases that specifically cleave double-stranded RNAs. Dicer processes long dsRNA into siRNA of 21-23 nt. v Small Interfering RNA (siRNA) is 21-23 nt double-stran

5、d RNA. It guides the cleavage and degradation of its cognate RNA.v RNA-Induced Silencing Complex (RISC) is an siRNA-directed endonuclease, catalyzing cleavage of a single phosphodiester bond on the RNA target. Company LogoRNAi分子机制分子机制一种蛋白复合物一种蛋白复合物 RISC(RNA-induced silencing complex)与这些小片段结合在一与这些小片段

6、结合在一起。起。RNA 分分 子子 的的 一一 条条 链链 被被 去去 掉掉 , 但但 另另 外外 一一 条条 链链 结结 合合 在在RISC 复合物上作为复合物上作为一个探针去识别一个探针去识别 mRNA 分子。分子。一个一个mRNA 分子可以分子可以和和 RISC 复合物上的复合物上的 RNA 片段配对片段配对 时时 ,它它就结合到复合物上然就结合到复合物上然后被切割、降解。后被切割、降解。这个这个 mRNA 相相应的基因就被沉默应的基因就被沉默双双 链链 RNA 结结 合合 到到 一一 个个 蛋蛋 白白 复复 合合 物物 Dicer 上上 , 并并 被被Dicer 切割成小片段切割成小片

7、段（siRNA）。）。明显的或不明显的或不明显的相应明显的相应的表型变化的表型变化Company LogoRNAi分子机制图分子机制图Company Logo2.试验的目的及意义试验的目的及意义 研究研究RNAi抑制类胡萝卜素代谢途径中抑制类胡萝卜素代谢途径中 生物合成酶基因表达在提高番茄红素含量生物合成酶基因表达在提高番茄红素含量中的作用中的作用 通过果实特异性的通过果实特异性的RNAi技术抑制类胡萝技术抑制类胡萝卜素代谢途径中番茄红素环化酶卜素代谢途径中番茄红素环化酶Lcy(lycopene cyclase)基因的表达进而抑制番基因的表达进而抑制番茄红素的降解来增加番茄红素的含量茄红素的降

8、解来增加番茄红素的含量 探索一种高效、快速的提高番茄红素探索一种高效、快速的提高番茄红素含量的方法含量的方法番茄红素可以清除自由基番茄红素可以清除自由基,保护细保护细胞内的脂类、脂蛋白、蛋白质和胞内的脂类、脂蛋白、蛋白质和DNA等生物大分子免受氧化破坏等生物大分子免受氧化破坏抗癌、防癌、防止心血抗癌、防癌、防止心血管疾病、保护皮肤等优管疾病、保护皮肤等优越的生理功能。越的生理功能。Company Logo3.实验材料和方法实验材料和方法纯系番茄品种纯系番茄品种大肠杆菌大肠杆菌XL1-blue表达载体表达载体pVCT2020农杆菌农杆菌LBA4404克隆载体克隆载体pMD18-TCompany

9、Logo实验方法实验方法PCR获得番茄获得番茄Pds和和Lcy片段片段选择目标基因选择目标基因克隆番茄克隆番茄Pds和和Lcy片段片段TA克隆获得重组载体克隆获得重组载体pMD-Lcy、pMD-Pds从从pCAMBIA1 301的的GUS基因分离内含子片段基因分离内含子片段载体构建载体构建酶切酶切pMD-Lcy获得获得Lcy正反向连接的载体正反向连接的载体pMD-srLcy将将内含子片段与内含子片段与pMD-srLcy连接构建成连接构建成pMD-RNAi酶切的酶切的Pds与与RNAi插入插入pVCT2020构建构建pVCT-RNAiCompany Logo实验方法实验方法转化转化将将pVCT-

10、RNAi质粒转入大肠杆菌质粒转入大肠杆菌XL1-blue农杆菌农杆菌LBA4404侵染无菌苗的子叶侵染无菌苗的子叶将鉴定正确的将鉴定正确的pVCT-RNAi质粒转入农杆菌质粒转入农杆菌LBA4404番茄子叶的番茄子叶的遗传转化遗传转化经分化、诱导生根并获得的植株进行移栽经分化、诱导生根并获得的植株进行移栽转基因植株的转基因植株的检测检测番茄红素的番茄红素的测定测定Company Logo3.2番茄番茄Pds启动子及启动子及Lcy片段的克隆片段的克隆v以番茄植株的幼叶为材料，采用以番茄植株的幼叶为材料，采用CTAB（十六烷基（十六烷基三乙基溴化铵）法提取番茄基因组三乙基溴化铵）法提取番茄基因组D

11、NA。v根据根据 GenBank中番茄的中番茄的Pds启动子序列设计特引物启动子序列设计特引物 P1:5GAG CAG GTAAAA GCTTCAATG CCCTA 3 P2:5GTG CAGAAC CAC TCC CTATAT CTT CT 3 以番茄以番茄DNA进行进行PCR扩增。扩增。Company Logo3.2番茄番茄Pds启动子及启动子及Lcy片段的克隆片段的克隆组成组成 体积体积10Pfu buffer ( Mg2+20mmol/L) 2.5LdNTP(10mmol/L) 0.5L上游引物上游引物(10pmol/L) 1.0L下游引物下游引物(10pmol/L) 1.0LPfu

12、DNA聚合酶聚合酶(5u/L) 0.2L模板模板DNA(100ng/L) 1.0LddH2O 18.8L总体积总体积 25.0LPCR反应体系：反应体系：PCR反应条件为反应条件为: 94预变性预变性3min 94变性变性40s 54退火退火40s 72延伸延伸2min 30s 30个循环个循环,最后最后72延伸延伸8min。Company Logo3.2番茄番茄Pds启动子及启动子及Lcy片段的克隆片段的克隆v同时，根据同时，根据 GenBank中番茄的中番茄的LcyB (X86452)和和LcyE(Y14387 )基因序列设计同源引物基因序列设计同源引物 P3:5CTATGG TGTTTG

13、 GGT GGATG 3 P4:5GTGCTC GATGCAACTGGCTTCTCTA3 以番茄以番茄DNA进行进行PCR扩增。扩增。PCR反应条件为反应条件为: 94预变性预变性3min 94变性变性40s 53退火退火40s 72延伸延伸1min 30个循环个循环,最后最后72延伸延伸8min。Company Logo3.2番茄番茄Pds启动子及启动子及Lcy片段的克隆片段的克隆v琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，做琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，做TA克隆，克隆，PCR鉴定获得重组载体鉴定获得重组载体pMD-Lcy、pMD-Pds。 v设计特异引物从设计特异引物从pCAMBIA1 301表达载体的

14、表达载体的GUS基因分离基因分离内含子内含子片段。片段。Company Logo3.3载体构建载体构建Sal酶切酶切pMD-Lcy后，电泳回收后，电泳回收Lcy小片段，将其小片段，将其插入酶切后的插入酶切后的pMD-Lcy载体中载体中BamH将质粒将质粒载体载体pMD-srLcy酶切去磷酸化，酶切去磷酸化，与经与经BamH和和Bgl酶切后的内含子连接酶切后的内含子连接从从pMD-RNAi载体切下载体切下RNAi，从，从pMD-Pds 载体载体切下切下Pds启动子，同时连到启动子，同时连到pVCT 2020中中 载体载体pMD-srLcy 载体载体pMD-RNAi 载体载体pVCT-RNAiCo

15、mpany Logo载体载体pVCT-RNAiCaMV35SGUSLcy内含子内含子LcyPds启动子启动子Company Logo转化转化pVCT-RNAi质粒转入质粒转入大肠杆菌大肠杆菌pVCT-RNAi质粒转入质粒转入农杆菌农杆菌农杆菌农杆菌侵染侵染无菌苗的子叶无菌苗的子叶Company Logo3.4番茄子叶的遗传转化番茄子叶的遗传转化番茄种子番茄种子接种于接种于1/2 MS培养基上培养基上无菌苗的子叶于分化培养基无菌苗的子叶于分化培养基重悬农杆菌浸染预培养后的子叶重悬农杆菌浸染预培养后的子叶810min接到分化培养基上接到分化培养基上暗培养暗培养23d25,光照光照1800lx,16

16、h光光/8h暗暗的光周期的光周期,培养约培养约7d预培养预培养2d暗培养暗培养2dCompany Logo3.4番茄子叶的遗传转化番茄子叶的遗传转化转入抑菌培养基转入抑菌培养基转到选择培养基，进行抗性筛选转到选择培养基，进行抗性筛选抗性芽抗性芽(23cm) 插入到生根培养基插入到生根培养基生根生根(34cm)后的植株开瓶炼苗后的植株开瓶炼苗移栽到大棚中让其自然生长直到结果移栽到大棚中让其自然生长直到结果MS+02mg/LIAA+1mg/L6-BA+Sucrose+300mg/L羧苄青霉素羧苄青霉素+50mg/L的卡那霉素的卡那霉素每每2周继代一次周继代一次,每次降低每次降低Cb的浓度的浓度7d

17、35dMS+02mg/L IAA+1mg/L 6-BA+3%Sucrose+300mg/L羧苄青霉素羧苄青霉素Cb7dCompany Logo3.5转基因植株的检测转基因植株的检测vPCR检测：提取卡那霉素抗性植株及非转基因检测：提取卡那霉素抗性植株及非转基因植株植株(阴性对照阴性对照)的总的总DNA,进行进行PCR检测。检测。 PCR：用：用P3单引物进行扩增单引物进行扩增,反应体系同扩增反应体系同扩增Lcy片段一样。片段一样。Company Logo3.6番茄红素的测定番茄红素的测定完全红熟的番茄果实完全红熟的番茄果实(每株每株2个个)研磨成糊研磨成糊10g (每株每株)番茄糊番茄糊,加入

18、适量的氯仿加入适量的氯仿下层液体至一新的下层液体至一新的50mL的离心管中的离心管中,向番茄残渣中再加入适量氯仿抽提向番茄残渣中再加入适量氯仿抽提U-1800紫外分光光度计在紫外分光光度计在502nm波长下波长下测定番茄红素含量测定番茄红素含量,制作标准曲线制作标准曲线35避光提取避光提取4h，离心，离心重复抽提重复抽提2次次,最后用氯仿定容到最后用氯仿定容到50mLCompany Logo4.实验结果实验结果4.1番茄番茄Pds启动子及启动子及Lcy片段的克隆及序列测定片段的克隆及序列测定v根据所设计的特异引物从番茄基因组中分别获根据所设计的特异引物从番茄基因组中分别获 得了长得了长302b

19、p的的Lcy片段片段(图图1)和长和长1790bp的的Pds启动子片段启动子片段(图图2),同时从同时从pCAMBIA1301载体中的载体中的GUS基因中分离了一段内含子片段。测基因中分离了一段内含子片段。测序结果表明所扩增的片段与序结果表明所扩增的片段与GenBank中所发表中所发表的序列一样。的序列一样。Company LogoCompany Logo4.2 转基因植株的检测转基因植株的检测v通过抗性筛选获得了通过抗性筛选获得了7株转化再生植株株转化再生植株,分别提取分别提取这这7株植株的株植株的DNA进行进行PCR检测检测,其中其中5株扩增出株扩增出了预期的和质粒了预期的和质粒(阳性对照

20、阳性对照)中扩增的一样的片段中扩增的一样的片段,而阴性对照没有出现此带而阴性对照没有出现此带(图图3),表明外源基因已表明外源基因已经整合到了番茄基因组中。经整合到了番茄基因组中。Company Logo4.2 转基因植株的检测转基因植株的检测Company Logo4.2 转基因植株的检测转基因植株的检测v将将PCR鉴定为转基因的植株炼苗后鉴定为转基因的植株炼苗后,移载到大棚中移载到大棚中让其自然生长直到结果让其自然生长直到结果,获得了转基因番茄果实获得了转基因番茄果实(图图4)。Company LogoCompany Logo4.5 转基因植株的番茄红素分析转基因植株的番茄红素分析v以每以

21、每100g鲜重番茄果实中番茄红素含量为纵坐标鲜重番茄果实中番茄红素含量为纵坐标,以转基因植物及非转基因植株为横坐标绘制坐标以转基因植物及非转基因植株为横坐标绘制坐标图图(图图5)。Company Logo4.5 转基因植株的番茄红素分析转基因植株的番茄红素分析Company Logo4.5 转基因植株的番茄红素分析转基因植株的番茄红素分析v测定结果表明所获得的测定结果表明所获得的5株转基因番茄果实的番茄株转基因番茄果实的番茄红素测定都比非转基因番茄果实中番茄红素高红素测定都比非转基因番茄果实中番茄红素高,其其中中1号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多,

22、比对照增加了比对照增加了3.2倍倍,5株番茄果实中番茄红素含量株番茄果实中番茄红素含量平均比对照增加了平均比对照增加了2.8倍。倍。Company Logo5.讨论讨论v由于番茄红素是由由于番茄红素是由-环化酶和环化酶和-环化酶两条途径环化酶两条途径转化为其它的类胡萝卜素的转化为其它的类胡萝卜素的,因此为了完全阻止番因此为了完全阻止番茄红素的转化茄红素的转化,本实验分析了本实验分析了-环化酶和环化酶和-环化酶环化酶的基因序列的基因序列,找到这两个基因的完全保守区域确定找到这两个基因的完全保守区域确定为干扰的目标区域。为干扰的目标区域。Company Logo内含子的作用内含子的作用v内含子与基

23、因表达调控有关内含子与基因表达调控有关,而且起到提高基因表而且起到提高基因表 达水平的作用达水平的作用,因此为了达到最大的干扰效果因此为了达到最大的干扰效果,本实本实验设计验设计RNAi载体的构建方案载体的构建方案: 通过一段内含子把通过一段内含子把Lcy基因基因DNA片段的片段的3端以正端以正反两个方向连接起来反两个方向连接起来,并且内含子的方向与基因转并且内含子的方向与基因转录的方向一致来构建录的方向一致来构建RNAi干扰片段干扰片段.Company Logo转基因植株的获得转基因植株的获得v在农杆菌浸染过程中在农杆菌浸染过程中,农杆菌太浓农杆菌太浓,在后来的培养中在后来的培养中外植体容易

24、褐化、坏死外植体容易褐化、坏死;农杆菌太稀获得的抗性植农杆菌太稀获得的抗性植株的机会就减少株的机会就减少,因此因此,应适当掌握农杆菌的浸染浓应适当掌握农杆菌的浸染浓度。度。v用液体用液体MS培养基重悬农杆菌是很必要的培养基重悬农杆菌是很必要的,可以降可以降低农杆菌对外植体的毒害低农杆菌对外植体的毒害,增加外植体的成活率。增加外植体的成活率。Company Logo转基因植株的获得转基因植株的获得v选择培养后的番茄子叶外植体在抗性培养基上培选择培养后的番茄子叶外植体在抗性培养基上培养养2周后部分外植体的伤口变褐变黄或是长出白色周后部分外植体的伤口变褐变黄或是长出白色的愈伤组织的愈伤组织,最后在选

25、择培养中褐化、坏死了。最后在选择培养中褐化、坏死了。v部分外植体在选择培养中能长出致密的绿色愈伤部分外植体在选择培养中能长出致密的绿色愈伤组织组织,1个月后能形成正常的绿芽个月后能形成正常的绿芽,在含在含Kan的生根的生根培养基中也能形成根系发达的植株。培养基中也能形成根系发达的植株。Company Logo植物表达载体的构建植物表达载体的构建v由于农杆菌浸染过程中由于农杆菌浸染过程中T-DNA之间的片段较小更之间的片段较小更容易进入植物基因组中容易进入植物基因组中,因此在构建载体时因此在构建载体时,本实验本实验用用Pds启动子和启动子和RNAi片段替换掉片段替换掉pVCT-2020载体中载体中GUS基因及其基因及其35S启动子启动子,减少了减少了T-DNA中其它非目的基因的干扰。中其它非目的基因的干扰。Company Logo启动子的选择启动子的选择v目前目前,报道的转基因实验中