生物化学实验

1、生物化学实验(代谢部分) 指导教师:王国彦 实验一 氨基转移反应的定性鉴定n实验目的n1. 学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理；n2. 进一步掌握纸层析的原理和操作技术；n3. 了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。n实验原理实验原理n氨基移换酶也称转氨酶,它能催化-氨基酸的氨基与-酮酸的-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷

2、氨酸丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。它们催化的反应如下：n上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。析法及光电比色法等。n本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。n试剂和器材n1. 试剂n(1) 实验动物-家兔n(2) 1/15mol/L磷酸缓

3、冲液（pH=7.4）n(3) 1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）n(4) 1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）n(5) 0.1%碳酸氢钾溶液n(6) 0.05%碘乙酸溶液n(7)15%三氯醋酸溶液n(8) 标准丙氨酸溶液(0.1%)n(9) 标准谷氨酸溶液(0.1%)n(10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液n(11)酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再加入新蒸馏的无色的苯酚150g。在水浴中加热搅拌，混合至酚完全溶解。将该溶液倒入盛有100ml蒸馏水的500ml分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7-10h，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液（即酚溶剂），放出下层，贮

4、存在棕色试剂瓶中备用。n2. 器材n(1) 解剖刀、剪及镊子。n(2) 解剖盘。n(3) 表面皿。n(4) 匀浆器。n(5) 台秤。n(6) 离心管和离心机（台式）n(7) 试管及试管架n(8) 恒温水浴n(9) 毛细玻璃管n(10)直尺n(11)2H铅笔n(12)层析滤纸（国产新华1号滤纸）n(13)电热鼓风干燥箱n(14)层析用具：玻璃钟罩、层析缸和小烧杯。n针、线、喷雾器。操作方法操作方法n1. 酶液的制备n将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3ml磷酸缓冲液。研 成 匀 浆 后 ， 倒 入 离 心 管 中 ， 在2500r/mi

5、n的条件下，离心5min，取上清液，即为制备的酶液。n2.体外氨基移换反应n取2支试管，编号。向1号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15min，做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后向1、2号试管中各加入1%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37-40恒温水浴中保温1.5-2h。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向第2号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴以沉淀蛋白质终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，2500r/min,5min。将上清液转移到试管中，用塞塞紧放置于低温处

6、备用。n 3.纸上层析法检查n两人合用一张滤纸(宽15cm，长20cm)，在其一端距边缘1.5cm处，用铅笔轻画一条与纸边平行的直线做为层析基线，在基线上每隔2cm用铅笔点一小点，共8点，点外画一半径为1.5mm的小圆圈。如图所示：n每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机吹干，再点下一次，重复3-4次，点样量应均匀相等。完成点样后，将滤纸卷成圆筒，用线将两端缝合，并留一宽缝，以免接触产生毛细现象。缝好后放入层析罩内。n用被酚所饱和的水溶液，平衡20min后，用

7、带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂，用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入60-80烘箱中显色10-15min。n氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红色斑点。实验二 脂肪酸的-氧化n实验目的n1.了解脂肪酸的-氧化作用；n2. 通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定-氧化作用的方法及其原理。n实验原理n根据氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁酸。乙酰乙酸

8、、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。 n本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：n2NaOH+I2NaIO+NaI+H2OnCH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOHn 碘仿n剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。nNaOI+NaI+2HClI2+2NaCI+H2OnI2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaIn根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。n试剂和器材n1

9、. 材料n动物：家兔n2. 试剂n(1)Locke氏溶液：取0.9g氯化钠、0.042g氯化钾、0.024gn氯化钙、0.015g碳酸氢钠及0.1g葡萄糖，溶于水中，稀释到100mln(2)0.1mol/L碘溶液:称取12.7g碘和约25g碘化钾,溶于水中,稀释到1000ml,混匀,用标准硫代硫酸钠溶液标定.n(3)pH7.6,mol/L的磷酸缓冲液.n(4)0.2mol/L丁酸溶液:取18ml正丁酸,用1mol/L氢氧化纳溶液中和至pH=7.6,并稀释至1000ml。n(5)15%三氯乙酸溶液。n(6)10%氢氧化钠溶液。n(7)10%盐酸溶液。n3. 器材n玻璃皿 锥形瓶（50ml） 试管

10、及试管架 移液管(2.5ml) 漏斗 微量滴定管(5ml) 剪刀及镊子 小台秤 恒温水浴n操作方法n击毙动物（家兔），迅速放血，取出肝脏，在玻璃皿上剪成碎糜。n取50ml锥形瓶2个，各加入3ml Locke氏溶液和2ml pH7.6的磷酸缓冲液。在一个锥形瓶中，加入3ml0.2mol/L丁酸溶液，另一个锥形瓶作为对照。取约0.5g肝组织两份（相等重），分别置于两个锥形瓶内，混匀，于37恒温水浴内保温。n保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2ml 15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3ml 0.2mol/L丁酸溶液。混匀，静置15min后过滤，分别吸取5ml滤液，放入另外两个锥形瓶中，各加5ml 0.1N碘溶液和10%NaoH 5ml，摇匀后静置10分钟加入5ml 10% HCl中和。然后，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，加几滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失，记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠的毫升数，并按式计算样品丙酮含量：n丙酮含量=（BA）0.966710n 5n式 中 ， B 为 测 定 对 照 实 验 所 消 耗 的0.1mol/L硫代硫酸钠