PCR技术详细步骤(共6页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上PCR技术详细步骤从RNA抽提到电泳鉴定RNA抽提一，准备工作1， 实验器具与材料：（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul（2） 吸头：1ml、200ul、20ul（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4） EP管1.5ml、100ul（5） 玻璃研磨器（6） 容量瓶：1000ml（7） 盐水瓶：100ml（8） 15ml塑料管一个（配75乙醇用）2， 实验器具的处理与准备（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱

2、中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1DEPC水中泡8小时左右，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。（3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3， 试剂配制和准备：（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压。（2） 75乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无

3、水乙醇1:3），然后放于-20备用。（3） 异丙醇：放入棕色瓶（4） 氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2 分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心

4、15分钟。3 RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20中1小时，后12000rmp离心10分钟。34 RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5 RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录。TRIzo

5、l法抽提总RNA细胞1×107组织100mg加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）颠倒混匀15S，室温5分钟4，离心12000rmp，15分钟转上层水相（约400-500l）于另一新1.5mlEP管中加等体积异丙醇（约400 -500l），混匀后-20中1小时4，离心12000rmp，10分钟弃上清加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml4离心7500rmp，5分钟弃上清，超净工作台开风机

6、干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20l（10l-20l）（可在55-60水中，<10分钟助溶）立即保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录4逆转录（RT）一，准备工作1， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1.5ml、100ul（4）水浴箱2，实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实

7、验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。（2）RT中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）（OD×33×）/（分子量×X）二，RT时注意事项：为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。三，RT步骤用SS逆转录酶进行RT（20ul体积）1， 准

8、备0.65ml的EP管2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3， 65水浴5分钟后，立刻0冰水浴至少1分钟。4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SS逆转录酶。5， 短暂离心6， 50水浴60分钟进行逆转录。7， 70水浴15分钟灭活逆转录酶8， -20保存，或立即进行PCR。用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1， 准备0.65mlEP管2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板R

9、NA3， 稍离心，100沸水裕1min4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶5， 稍离心，封口膜封口，42水浴90作RT6， 100沸水裕3min灭活AMV7， 立即PCR或-20保存。5聚合酶链式反应（PCR）二，准备工作8， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul2，实验器具的处理与准备(1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。3, 试剂配制和准备：(1) 双蒸水： 100ml盐水

10、瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。(2) PCR中所需要的各种试剂三，PCR时注意事项：佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。四，PCR步骤1， 准备100ul EP管2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）ddH2O 37.5ul ×？10mM dNTP 1ul ×？10×PCR buffer 5ul ×？25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？上游引物 1ul ×？下游引物 1ul ×？模板cDNA 1ul3， 稍离心4， 100沸水浴1分

11、钟5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）6， 再加入50ul液体石蜡封闭7， 10000rmp离心1分钟8， PCR条件94 1min58 50sec72 1min30sec进行40个循环，然后72 10min 完后4保温。9，10000rmp离心5min10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20保存。6电泳鉴定一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：10ul（2）吸头：20ul（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个（4）三角烧瓶：50ml一个（5）琼脂糖2，实验器具的处理与准备(1) 塑料制品：（包括吸头等）送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。（2）电泳板及

12、电泳槽：用自来水冲洗干净备用3, 试剂配制和准备：(1) 电泳缓冲液（TAE）：先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。（2）琼脂糖溶液（1.0）：50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g

13、琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer二，电泳鉴定时注意事项：佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。五，电泳步骤1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。9， 用透明胶封