幽门螺杆菌感染对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响

1、    幽门螺杆菌感染对胃粘膜上皮细胞增殖 和凋亡的影响        摘要为研究幽门螺杆菌（Hp）感染对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响，探讨胃粘膜上皮细胞增殖与细胞凋亡之间的关系，采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术、增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色对Hp阳性患者Hp根除前后及Hp阴性者胃粘膜上皮中增殖细胞、凋亡细胞进行原位观察和比较。结果Hp阳性患者胃粘膜细胞增殖指数、凋亡指数均显著增加，Hp根除后，上述指标均显著降低

2、，而Hp仍为阳性者上述指标则无显著性变化。胃粘膜细胞增殖指数与凋亡指数呈显著正相关。提示Hp诱导胃粘膜上皮细胞凋亡可能是刺激胃粘膜上皮细胞过度增殖的机制之一，使胃粘膜的不稳定性增加，从而增加患胃癌的危险性。关键词螺杆菌，幽门胃粘膜细胞凋亡增殖细胞核抗原EFFECTOFHELICOBACTERPYLORIONGASTRICEPITHELIALCELLPROLIFERATIONANDAPOPTOSISLiuHaifeng，LiuWeiwen，FangDianchun，etalDepartmentofGastroenterology，South-WestHospitalMilitaryMedical

3、University，Chongqing400038AbstractThisstudywasattemptedtohaveanunderstandingofrelationshipbetweenHelicobacterpylori（Hp）andproliferationaswellasapoptosisofgastricepithelidcells，andbetweencellproliferationandapoptosisEndoscopicmucosalbiopsiesweretakenin72caseswithchronicgastritisWithHppositive（n46）bio

4、psieswererepeatedafterHperadication；incasesofHpnegative（n26）specimensfromthesomesitesobtaimedTerminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabelling（TUNEL）techniqueandproliferativecellnuclearantigen（PCNA）immunohistochemicalstainingwereappliedforinvestigationResultsshowedthat：（1）Hpinfectiondi

5、dinducecellproliferationandapoptosisinparalle；（2）HpinfectedmucosademonstratedveryhighapoptoticandPCNAlabellingindices，whichdeclinedaftertherapyItissupposedthatHpinducedcellapoptosismaybeatiggerfactorforcellhyperproliferation，resultingincarcinogenesisKey wordsHelicobacterpyloriGastricmucosaApoptosisP

6、roliferationcellnuclearantigen近年众多流行病学资料表明幽门螺杆菌（Hp）感染与胃癌的发生密切相关，但对其致癌机理尚未阐明。我们采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术1、增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色对Hp阳性患者Hp根除前后及Hp阴性者胃粘膜上皮细胞增殖、细胞凋亡进行原位观察，研究Hp感染对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响，以及胃粘膜细胞增殖与细胞凋亡之间的关系，以探讨Hp可能的致癌机理。 材料和方法1研究对象：均为以上消化道症状在我院行胃镜检查的慢性胃炎患者，共72例，用活检钳采取胃粘膜组织标本。Hp检测包括尿素酶试验、

7、细菌培养和Warthy-Starry银染色，上述方法有2项以上阳性视为Hp阳性，全部均为阴性者判为Hp阴性。对Hp阳性者给予有机铋剂、呋喃唑酮、羟氨苄青霉素三联药物进行治疗，治疗结束后复查胃镜，停药4周后Hp仍保持阴性者为Hp根除。2胃粘膜上皮凋亡细胞的原位检测：试剂盒（Insitucelldeathdetectionkit，POD）为德国BoenrigerMannheim公司产品。染色步骤：（1）切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；（2）H2O2封闭30分钟阻断内源酶；（3）20mgL蛋白酶K消化液作用25分钟；（4）滴加TUNEL反应液，37，60分钟；（5）滴加过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，

8、37，30分钟；（6）DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照。3PCNA免疫组织化学染色：采用SP法。PCNA单克隆抗体（PC10）为北京中山公司产品，SP试剂盒为福州迈新公司产品。染色步骤按说明书进行。PBS代替一抗作阴性对照。4观察指标：光学显微镜下观察TUNEL染色及PCNA免疫组化染色切片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于1000个细胞，计数阳性细胞数，计算细胞凋亡指数及PCNA指数（增殖细胞指数）。5统计学处理：两样本均数比较采用t检验，两样本相关的比较采用直线相关分析。结果1Hp感染对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响：TUNEL染色阳性物质

9、呈棕黄色，位于细胞核内，浓缩的核质紧贴于核膜，或核质呈现均匀的染色。PCNA阳性物质呈棕黄色颗粒状，亦主要位于核内，少许细胞浆内有淡着色。Hp阴性患者，胃粘膜上皮凋亡细胞主要位于表层上皮中；Hp阳性患者，凋亡细胞可见于胃粘膜全层。PCNA阳性细胞则主要分布于粘膜中下部腺体中。Hp阳性患者胃粘膜上皮细胞凋亡指数及PCNA指数均显著高于Hp阴性患者，见表1，两组差异均有非常显著性意义（P）。表1Hp感染与胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的关系组别例数PCNA指数（，±s）凋亡指数（，±s）Hp阴性26Hp阳性46*注：Hp：幽门螺杆菌；PCNA：增殖细胞核抗原；* 与Hp阴性组比较P

10、2Hp根除前后胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的变化：经前述三联药物治疗后，Hp根除者胃粘膜上皮细胞凋亡指数及PCNA指数均显著下降（P），而Hp仍为阳性者凋亡指数及PCNA指数亦有降低，但与治疗前相比无统计学差异，见表2。表2Hp根除前后胃粘膜上皮细胞PCNA指数及凋亡指数的变化组别例数PCNA指数（，±s）凋亡指数（，±s）治疗前治疗后治疗前治疗后Hp根除组36*Hp未被根除组10注：Hp：幽门螺杆菌；PCNA：增殖细胞核抗原；* 与同组治疗前比较P 3胃粘膜上皮细胞凋亡与细胞增殖的关系：经对Hp阳性患者Hp根除前后胃粘膜细胞凋亡指数与PCNA指数进行相关分析表明胃粘膜上皮细胞

11、增殖状态与细胞凋亡指数呈显著正相关（P）。讨论胃粘膜是由短寿命的细胞组成的，细胞增殖与细胞凋亡共同维持其数量的动态平衡。本组结果显示，在Hp阴性患者胃粘膜中，凋亡细胞主要位于粘膜表层，形成“凋亡细胞带”，增殖细胞主要位于粘膜中下部，形成“增殖细胞带”，这种分布特点体现了胃粘膜上皮自基底向表层逐渐成熟、衰老、死亡的生长规律。Hp阳性患者胃粘膜凋亡细胞失去了上述分布特点，细胞凋亡指数及增殖指数均显著增加，提示Hp感染可导致胃粘膜细胞增殖和凋亡的调节紊乱，使胃粘膜不稳定性增加。本研究通过PCNA免疫组化染色方法发现，Hp阳性患者胃粘膜细胞PCNA指数较Hp阴性者明显增加，Hp根除后PCNA指数显著下

12、降，说明Hp感染促进了胃粘膜细胞增殖，与文献报道一致2，3。但Hp感染促进胃粘膜上皮细胞过度增殖的机制尚不清楚。我们采用TUNEL技术对Hp阳性患者Hp根除前后及Hp阴性者胃粘膜上皮凋亡细胞进行原位观察，结果显示，Hp感染可诱导胃粘膜上皮细胞凋亡，胃粘膜细胞增殖状态与细胞凋亡指数呈正相关，提示Hp诱导胃粘膜上皮细胞凋亡可能是促进胃粘膜细胞过度增殖的机制之一。Hp感染增加胃粘膜上皮细胞凋亡，为维持细胞增殖和死亡的动态平衡，胃粘膜上皮发生代偿性增殖反应，处于过度增殖状态的细胞更易受致突变、致癌物的损伤而产生具凋亡抗性的细胞群体，从而破坏胃粘膜上皮细胞增殖和死亡的动态平衡，促进胃癌的发生。Hp感染诱

13、导胃粘膜上皮细胞凋亡的机制尚不清楚。可能与Hp分泌的细胞毒素如cagA和vacA等、Hp尿素酶分解尿素产生的氨、Hp感染后炎症反应中释放的细胞因子和氧自由基、胃腔中维生素C含量减低有关4。另外，Hp感染亦可能通过影响细胞凋亡相关基因的表达而诱导胃粘膜上皮细胞凋亡5。具体机制有待深入研究。总之，Hp感染可能通过诱导胃粘膜上皮细胞凋亡，刺激胃粘膜细胞过度增殖，使其具有较高的癌变易感性，这在胃癌发生中可能具有重要意义。因此，深入研究Hp诱导胃粘膜上皮细胞凋亡的作用及其机制，将有助于提高对胃癌发生的机理的认识。?军队医药卫生“九五”重点课题作者单位：400038重庆，第三军医大学西南医院消化科参考文献

14、1GavrieliY，ShermanY，ShmuelA，etalIdentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentationJCellBiol，1992，119：493-5012FanXG，KelleherD，FanXJ，etalHelicobacterpyloriincreaseproliferationofgastricepithelialcellsGut，1996，38：19-223梁后杰，刘为纹，房殿春，等幽门螺杆菌清除前后胃粘膜增殖状态的变化中国实用内科杂志，1996，16：23-244MartinLS，AlbertJFThetwo