断流术削弱胃粘膜细胞增殖能力及降钙素基因相关肽保护作用的研究

1、断流术削弱胃粘膜细胞增殖能力及降钙素基因相关肽保护作用的研究目的研究门静脉奇静脉断流术(下称断流术)对胃粘膜细胞增殖能力的影响,并试用降钙素基因相关肽(calcitonin generalated peptide,CGRP)保护术后胃粘膜。方法Wistar大鼠分正常对照组8只,肝硬变合并门静脉高压性胃病(portal hypertensive gastropathy,PHG)模型对照组12只,断流手术组12只,断流术加CGRP保护组12只,用放射自显影技术测定各组胃粘膜细胞增殖参数。结果肝硬变PHG大鼠断流术后胃粘膜细胞DNA合成期、细胞周期较正常及模型组延长(P0.01),标记指数相应降低(

2、P0.01)。各参数变化主要表现在胃体部。应用CGRP后DNA合成期、细胞周期缩短,标记率上升(P0.01)。结论断流术削弱了胃粘膜细胞增殖能力,可能是易发生术后PHG胃出血的因素之一,CGRP改善了粘膜细胞增殖受抑状态,可保护胃粘膜,减少出血。关键词胃粘膜细胞降钙素基因相关肽 The effect of portaazygous disconnection on gastric mucosal proliferation and the protection of calcitonin generelated peptide Guan Honggeng,Chen Yiren,Qian Hai

3、xin,et al.Division of General Surgery.First Affiliated Hospital.Suzhou Medical College,Suzhou 215006.Objective To investigate the cytokinetic mechanism behind changes of gastric mucosal epithelia proliferation after portaazygous disconnection and the protection of calcitonin generelated peptide(CGRP

4、) on postoperative gastric mucosa.Methods Wistar rats were divided into four groups:normal group(n=8),model group with cirrhosis and portal hypertensive gastropathy (PHG)(n=12),disconnective group(n=12)and post-disconnection plus CGRP group (n=12).Gastric mucosal cellular proliferative parameters fr

5、om the above groups were measured by the radioscintigraphy.ResultsCompared with the normal and the model rats.Ts and Tc stages of gastric mucosal cells in the postoperative rats were significantly prolonged (P0.01),an apparent lowering of labelling index (LI)appeared (P0.01).The change was signifant

6、 in gastric body,not in gastric antral portion.After the postoperative rats were treated by CGRP Tc.Ts stages and LI recovered (P0.01).ConclusionsDisconnective operation could weaken gastric mucosal cellular proliferative ability,this could be one of the rebleeding factors.CGRP showed a considerable

7、 protection for the gastric mucosa against postoperative rebleeding.Key wordsGastric mucosa CellsCalcitonin gene-related peptide断流术是治疗门静脉高压食管胃底静脉破裂出血的重要方法,但仍有再出血问题。近来提出断流术后门静脉高压性胃病(portal hypertensive gastropathy,PHG)出血的观点。甚至断流越彻底,PHG病变越严重1,2。断流术导致或加剧PHG的机制尚不清楚。我们建立肝硬变PHG的门静脉高压症大鼠模型,研究断流术后胃粘膜细胞增殖参数的

8、变化,探讨断流术加剧PHG的机制,以阐明除静脉曲张因素以外的再出血原因,并用CGRP改善术后胃粘膜细胞增殖受抑状态,保护胃粘膜,减少再出血机会。现报告如下。材料和方法1.试剂与动物:Wistar大鼠,6周龄,体重160180g(苏州医学院实验动物中心提供)。CGRP为Sigma公司产品。H4型核乳胶购于北京原子能研究所。2.实验分组设计:正常对照组8只大鼠。PHG模型对照组12只大鼠,硫代乙酰胺60ml/kg腹腔注射每日一次,连续16周。断流手术组12只大鼠,切脾后从胃小弯中点向上至食管下端0.71.0cm将周围血管切断结扎,胃底浆肌层切开,粘膜下静脉环形缝扎及幽门成形术。术后饲养一个月。断流

9、术CGRP保护组12只PHG模型大鼠,手术方法同上。术后第4周起每天股静脉推注CGRP50ug/kg 1次,计10次。3.放射自显影研究:四组动物同批行放射自显影研究。剖腹穿刺门静脉,测得门静脉压力。取肝组织常规病理检查。将全胃取出,大弯侧纵向剖开,生理盐水冲洗粘膜层,从胃体、胃窦部各切取胃壁全层0.5cm0.5cm立即放入2mlRPMI 1640培养液中,PH7.27.4,含3H-脱氧胸苷(3H-TdR)1微居里(uci)/ml,37搅拌孵育15分钟后,用不含同位素的RPMI 1640培养液冲洗3次。再于RPMI 1640培养液(无3H-TdR)搅拌孵育1小时后,放入含3H-TdR 20uc

10、i/ml的2mlRPMI 1640培养液37孵育15分钟。取出后在Carnoy(配制：无水乙醇、氯仿、冰醋酸的体积比为631)液中固定按涂片法涂H4型原子核乳胶,干燥过夜,显影、定影、HE染色。细胞标上的银粒大于4个为标记细胞,420个为轻标记细胞,大于20个为重标记细胞。以标记细胞所在范围的上皮细胞为增殖区细胞。标记率(LI)=标记细胞数/增殖区细胞总数约1 000个100%。DNA合成时间(TS)=高浓度标记细胞(Nh)/低浓度标记细胞 (Nw结果1.肝脏病检及门静脉压力测定值:各组大鼠肉眼观察肝脏表面有大小不一的结节。镜检肝脏组织正常结构消失,纤维大量增生。肝细胞结节状再生,假小叶形成符

11、合肝硬变病理特征。正常大鼠门静脉压力为1.160.02kPa,模型组升高至1.960.02kPa(P0.01)。断流术后2.010.02kPa,与模型组比较无明显升高(P0.05)。CGRP保护组1.990.24kPa,与模型组、断流术组的差异无统计学意义(P0.05)。2.断流前后胃粘膜细胞周期时相参数:(1)胃粘膜不同部位细胞LI的差别:正常大鼠窦部3H-TdRLI显著高于胃体部(P0.01),模型组及断流术组窦部标记率差别更为明显(P0.01)。组间比较细胞LI下降主要表现在胃底部,而窦部变化不大(表1)。表1正常、门静脉高压及断流术后大鼠胃体、胃窦粘膜LI的差别组别胃窦LI胃体LIt值

12、P1组(正常对照)2组(模型对照)3组(断流术组)* (2)断流术后胃粘膜周期时相参数变化:门静脉高压鼠胃粘膜细胞DNA合成期及细胞周期较正常组显著延长。断流术后较模型组DNA合成期和细胞周期延长。说明断流术使代谢障碍的胃粘膜细胞增殖能力进一步下降(表2)。表2断流术对大鼠胃体粘膜细胞动力学参数的影响组别LI(%)Ts(h)Tc(h)1组(正常对照)82102组(模型对照)143213组(断流术组)*22630* 3.CGRP对断流术后大鼠胃粘膜细胞的保护作用：门静脉高压症大鼠断流术后静脉注射CGRP50ug/kg 10次后,发现胃粘膜细胞增殖受抑情况明显改善,表现在细胞DNA合成期及细胞周期

13、明显缩短(P0.01),接近术前水平,但与正常大鼠比较,增殖能力仍然低下(表3)。表3CGRI对断流术后大鼠胃体粘膜细胞增殖参数的影响组别LI(%)Ts(h)Tc(h)断流手术组22630断流术CGRP15121 讨论1.肝硬变PHG大鼠胃粘膜细胞增殖状态：在正常状态下,胃粘膜上皮细胞保持动态平衡,并处于不断更新状态。胃腺颈部干细胞不断补充脱落的上皮细胞,以维持胃粘膜组织的稳定。有学者对人胃粘膜研究,测得代表细胞增殖能力的LI为5%和6%。Kuwayama3测得大鼠胃粘膜细胞LI为5.1%。本实验用放射自显影二次脉冲法测得正常大鼠胃体粘膜LI为6.92%。1993年Hsieh等4从门静脉部分结

14、扎(PVL)肝前型门静脉高压模型发现,大鼠胃底部LI在PVL后2个月、4个月分别为3.9%和4.0%,明显低于正常组的5.7%,本实验肝硬变合并PHG动物模型,采用放射自显影法测得模型大鼠LI 4.6%,低于正常的6.9%,而DNA合成时间为6.37小时,细胞更新周期为143小时,较正常组延长,说明门静脉高压时胃粘膜细胞更新过程缓慢,增殖能力低下。可能是门静脉压力上升,胃静脉回流受阻导致组织水肿,减少了细胞更新所需能量供给;胃粘膜下层动静脉通路开放致粘膜层有效供血量不足,以及各种内、外源性调节因素发生变化,胃粘膜增殖能力低下使粘膜自身保护能力下降,对各种损伤敏感性增加,构成了PHG胃出血的病理

15、生理基础。2.断流术后胃粘膜细胞增殖参数改变:断流术后门静脉高压大鼠的胃粘膜细胞LI为3.12%,较正常组及PHG组均明显降低。DNA合成期为24小时,细胞周期为226小时,均较正常组及PHG组延长,说明断流后胃粘膜细胞增殖能力在PHG低下的基础上进一步减弱。原因可能为:(1)结扎贲门胃底周围血管后,使该区域胃静脉回流进一步受阻;(2)横断胃底再缝合直接损伤胃粘膜;(3)去除迷走神经后削弱了神经内分泌调节;(4)胃粘膜局部保护性因素如PGE2、CGEP含量于术后下降。由于胃粘膜保护能力进一步下降,出血的可能性较术前增加。另外,本实验还发现正常大鼠胃体部粘膜细胞标记率明显低于胃窦部(见表1)，而

16、门静脉高压性大鼠及断流术后这种差别增大。各组间比较，胃粘膜细胞动力学改变主要在胃底部,而窦部变化不明显。Kuwayama等的解释是胃窦部上皮增生存在某种保护因素,我们体会胃贲门处局部存在门静脉高压,断流术时离断结扎的血管主要在胃上1/2。3.CGRP对断流术后胃粘膜的保护：对胃粘膜的保护因素研究较多的是粘膜血流及前列腺环素(PGI2)。主要是通过增加胃微循环血量而发挥作用。而PHG时胃已处于充血状态,断流术使PHG充血加重及胃血流量增加。理论上讲增加胃血流量不适于PHG胃粘膜保护。降钙素基因相关肽(CGRP)是1982年发现的生物活性肽。免疫细胞化学显示CGRP广泛存在于中枢和外周神经系统。有

17、人5给鼠、狗静脉注射外源性CGRP均发现能抑制胃酸分泌,亦有学者证明CGRP刺激小鼠离体胃释放生长抑素。说明CGRP对胃粘膜具有保护作用。本实验将CGRP用于离断术后的胃粘膜保护,结果显示胃粘膜细胞LI回升,DNA合成期、细胞周期缩短,改善了术后细胞增殖受抑状况,使胃粘膜细胞增殖能力接近术前水平。另外,加用CGRP后,大鼠门静脉压力并无明显变化,提示其保护作用与循环因素关系不大。可能因促进胃释放生长抑素,改善了局部内环境。断流术去除迷走神经,使神经内分泌调节网络的内源性CGRP不足,外源性CGRP使之得以纠正,但CGRP仍不能使胃粘膜细胞增殖能力达正常水平,说明还有其它影响因素。能否防治这一再出血因素，需今后验证。参考文献1陈易人.青木春夫式断流术.实用外科杂志,1990,10:197.2姚常柏,夏振龙,张丽红.门奇断流术致胃壁缺血的研究.肝胆外科杂志,1994,2:4.3Kuwayama H.Effects of waterimmersion on gastric antral and fundicepithelial proliferation.Gastroenteroliogy,1