酸枣仁合剂的薄层鉴别及酸枣仁皂苷A的含量测定

1、酸枣仁合剂的薄层鉴别及酸枣仁皂苷A的含量测定    【摘要】  目的：建立酸枣仁合剂的鉴别和含量测定方法。方法：采用TLC法和HPLC法。结果：TLC法鉴别酸枣仁合剂中知母、茯苓和川芎等药材；HPLC测定酸枣仁皂苷A的含量，酸枣仁皂苷A在0.551.1 mg/mL范围内线形关系良好（r0.9997），平均加样回收率为100.45%，RSD为1.30%。结论：鉴别重复性好、专属性强，含量测定方法简便，准确。 【关键词】  酸枣仁合剂；薄层色谱法；高效液相色谱法；酸枣仁皂苷A    Abstract Obje

2、ctive:To identify Rhizoma Anemarrhenae, Poria and Rhizoma Chuanxiong, and to assay jujuboside A in Suanzaoren mixture. Methods:TLC and HPLC were used.Results:The spots of TLC were fairly clear. The HPLC method showed good repeatability. The linear range was 0.551.1 mg/mL, and the average recovery of

3、 jujuboside A was 100.45% with RSD of 1.30%. Conclusions:The method is simple, repeatable, accurate, and can effectively control the quality of Suanzaoren mixture.    Key words Suanzaoren mixture; TLC; HPLC; Jujuboside A    酸枣仁合剂源于酸枣仁汤，出自汉代张仲景金匮要略?血痹虚劳脉证并治第六。论文论文参考网方中酸枣

4、仁养肝血、安心神为君药；川芎调血养肝、茯苓宁心安神为臣药；知母滋阴降火、清热除烦为佐药；甘草和中缓肝为使药。本方主治肝血不调、虚火内扰心神所致的心烦失眠等症。酸枣仁皂苷A为镇静催眠的有效成分之一，我们在文献1方法的基础上，改进提取、纯化方法，对酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A进行了测定，并对处方中部分药材进行了薄层鉴别，结果较为满意。    1  材料与仪器    LC?10A高效液相色谱仪（日本岛津公司），电子天平（B?N型，梅特勒?餐欣?多仪器上海有限公司）。酸枣仁皂苷A对照品（734?9404），知母、茯苓和川芎对照药材均购自

5、中国药品生物制品检定所，酸枣仁药材自购，经四川大学华西药学院王天志教授鉴定。酸枣仁合剂为四川志远嘉宝药业有限责任公司制备，其余试剂均为分析纯。    2  薄层鉴别    2.1  知母的薄层鉴别    取酸枣仁合剂样品20 mL，加乙醇40 mL，超声处理30 min后，加入浓盐酸2 mL，超声处理30 min，过滤，滤液浓缩至约5 mL，加水10 mL，用苯萃取2次，每次20 mL，分取苯层，用1%氢氧化钠溶液10 mL洗涤1次后，水洗3次，每次10 mL，苯萃取液水浴挥干，残渣加

6、苯1 mL溶解即得。另取知母对照药材3 g，用水50 mL回流提取1 h，过滤，滤液照供试品溶液方法制备知母对照药材溶液。取上述两种溶液各10 L，分别点于同一含0.4%CMC?Na的硅胶G薄层板上，以苯?脖?酮（101）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于室温、日光下检视，样品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照在相应位置无此斑点。    2.2  茯苓的薄层鉴别    取酸枣仁合剂样品20 mL，加乙酸乙酯30 mL，超声处理30 min，取乙酸乙酯层，即得。另取茯苓对照药材

7、2 g，加乙酸乙酯10 mL，超声处理30 min，取乙酸乙酯层，即得茯苓对照药材溶液。取上述两种溶液各10 L，分别点于同一含0.4%CMC?Na的硅胶G薄层板上，以环己烷?惨宜嵋阴?51）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下观察，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照在相应位置无此斑点。    2.3  川芎的薄层鉴别    取酸枣仁合剂样品20 mL，加乙醚50 mL，超声处理30 min，取乙醚层，减压浓缩至干，残渣加乙酸乙酯2 mL溶解即得。另取川芎对照药材3 g，加水50

8、 mL回流提取1 h，过滤，滤液同供试品溶液制备方法处理即得川芎对照药材溶液。取上述两种溶液各10 mL，分别点于同一含0.4%CMC?Na的硅胶G薄层板上，以环己烷?惨宜嵋阴脖?醋酸（210.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下观察，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照在相应位置无此斑点。论文参考网    3  酸枣仁皂苷A含量测定    3.1  色谱条件    采用Hypersil?C18（4.6 mm ID×150 mm

9、，5 m）色谱柱，以乙腈?菜?（3070）为流动相，检测波长为204 nm，流速0.8 mL/min，柱温25 。理论塔板数按酸枣仁皂苷A计算，不低于5 000，酸枣仁皂苷A与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，见图1。    图1  酸枣仁皂苷A液相色谱图    3.2  供试溶液的制备    取酸枣仁合剂供试品10 mL，置于处理好装大孔树脂（20 mm×150 mm），用60%乙醇洗柱至无色，再用蒸馏水洗柱至无色，备用的大孔树脂上，依次用蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、6

10、0%乙醇洗涤小柱，分别洗至流出液无色，控制流出速度为23 mL/min，用液300 mL，收集60%乙醇洗脱成分，旋转浓缩至干，残渣用甲醇溶解，并定容为2 mL，摇匀，离心，取上清液进样。    3.3  标准曲线的制备    精密称取酸枣仁皂苷A对照品0.0110 g，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，备用。分别精密吸取酸枣仁皂苷A对照品溶液（1.1 mg/mL）适量，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标，以对照品量（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线得回归方程：Y=1.677×

11、;105X-8.672×104（r0.9997）。酸枣仁皂苷A在0.551.1 mg/mL浓度范围Y与X呈良好线性。    3.4  精密度试验    精密吸取对照品溶液10 L，进样5次，峰面积积分值的RSD为1.13%，表明仪器进样精密度良好。    3.5  重复性试验    取同一批样品，制备6份供试样品溶液，并测定其酸枣仁皂苷A含量，6份含量的RSD为0.99%。    3.6  加样回收率试验&

12、#160;   取已知含量的一批酸枣仁合剂（0.233 mg/mL）10 mL，分别加入酸枣仁皂苷A溶液1.60、2.0、2.4 mL（浓度为1.2 mg/mL），按“供试溶液的制备”方法进行处理测定并计算回收率，平均加样回收率为100.45%，RSD为1.30%，见表1。    3.7  样品的测定    取酸枣仁合剂供试品（批号为041101、041102、041103、050101、050102、050103）各10 mL，按“1.3.2项下”方法制备，并测定含量，结果分别为：0.231、0.234

13、、0.235、0.227、0.236和0.233 mg/mL。表1  酸枣仁皂苷A的加样回收率注：酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A含量为0.233 mg/mL，平均加样回收率为100.45%。    4  讨论    酸枣仁中化学成分复杂，且酸枣仁皂苷A结构中无共轭体系，紫外吸收波长较短，检测极易受到干扰。对药材的测定，采用石油醚脱脂，氨水对正丁醇层进行碱化处理的方法，取得了很好的分离效果，且重现性良好。    酸枣仁合剂中，成分复杂，黄酮类成分在紫外区的干扰，处方中知母、甘草也含有皂苷，对酸枣仁皂苷A的测定影响很大，因此在纯化过程中，既要排除黄酮类的干扰，也要排除其它皂苷的影响。    对供试样品的预处理方法进行了筛选，索氏提取的酸枣仁合剂供试品，用水饱和的正丁醇萃取，发现干扰明显，酸枣仁皂苷A峰太小；选用大孔树脂柱处理，其主要用于水溶性化合物的分离纯化（因其在有机溶剂中的吸附能力极小），多用于皂苷及其它苷类化合物的分离。实验中，我们使用20%、40%、60%、80%乙醇分别洗脱，经测定，20%乙醇能将大部分水溶性成分洗脱出来，60%乙醇基本将酸枣仁皂苷A洗脱。&