分子生物学实验大纲

1、分子生物学实验教学大纲课程编码：1711150201课程名称：分子生物学实验学时/学分：18/1关联课程：生物化学、细胞生物学、遗传学、基因工程适用专业：生物技术开课教研室：生物技术教研室一、 课时分配与考核权重本课程的内容依据高等学校生物技术专业教育的培养目标以及毕业生基本要求和培养方案，以某一目的基因为主线，从PCR扩增目的基因、质粒的提取、琼脂糖凝胶电泳、转化、连接、酶切、目的片段的回收等内容，共18学时1学分，训练学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，使学生对分子生物学方法的应用和意义有具体而全面的理解，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其动手能力、独立

2、科研能力和科学、严谨、实事求是的学风。要求教师在授课过程中围绕课内教与学、课外导与做、线上线下紧密结合等环节，推进考评方式改革，重视过程性评价，突出基于能力的非标准化答案考试。基于该教学考核评价思路，本课程主要以平时实验报告、实验操作、期末实验操作技能测试等方式对学生进行考核评价，过程性评价占评价权重的60%，期末考试占评价权重的40%。课时分配与考核权重一览表序号实验项目名称课时数评价方法及考核权重01质粒DNA的提取2实验操作、实验报告15%，期末考试5%02琼脂糖凝胶电泳2实验操作、实验报告15%，期末考试5%03PCR技术扩增DNA片段4实验操作、实验报告15%，期末考试5%04转化4

3、实验操作、实验报告15%，期末考试5%05重组质粒DNA的酶切鉴定4实验操作、实验报告5%，期末考试5%06凝胶中DNA片段的回收与纯化2实验操作、实验报告5%，期末考试5%合计过程性评价70%，期末考试30%二、课程资源库1.参考书(1) 朱玉贤等.现代分子生物学(第4版).高等教育出版社.2013-1.(2) (美)Robert F. Weaver著；郑用琏等译.分子生物学(原著第五版).科学版社.2016-05.(3) 杨建雄.分子生物学.科学出版社.2015-09.(4) (美)FM.奥斯伯.精编分子生物学实验指南.科学出版社.2008-5.(5) (美)J.莎姆布

4、鲁克等著；黄培堂译.分子克隆实验指南.科学出版社.2005-03.(6) 卢圣栋，马清钧，刘培得.现代分子生物学实验技术.中国协和医科大学出版社,1999.(7) 钟卫鸿.基因工程技术实验指导.化学工业出版社,2007.(8) 梁国栋.最新分子生物学实验技术.科学出版社,2001.(9) 张维铭.代分子生物学实验手册.科学出版社，20072.期刊中国生物化学与分子生物学学报分子植物JGGGPB遗传Cell ResearchJournal of Molecular Cell Biologyj医学分子生物学Genes &Development Nature Genetics三、教学内容及教

5、学基本要求第12学时实验一 质粒DNA的提取分组要求：每组4-5人仪器设备：离心机、恒温振荡摇床离心管、微量移液器、灭菌锅、吸头、水浴锅、电泳仪、琼脂糖平板电泳装置实验目的：了解质粒在基因工程中的作用及提取质粒DNA的几种方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA。基本要求：掌握用质粒快速提取试剂盒提取质粒DNA的方法。实验原理：在溶菌酶和SDS作用下破壁释放DNA后，在强碱性条件下，DNA变性成单链，当加入乙酸钠适当中和PH时，质粒DNA复性，而ch-DNA和大分子RNA仍为单链结构，并与蛋白质SDS复合物被沉淀，质粒DNA留在溶液中。用乙醇沉淀上清液中的pDNA（质粒DNA）。考核方式与权重比例列表

6、考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告15%考核要点：质粒提取基本原理、微量移液器的使用期末测试5%考核要点：质粒提取基本原理、微量移液器的使用合计20%3-4学时实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA分组要求：每组4-5人仪器设备：恒温培养箱、台式离心机、高压灭菌锅、水平电泳系统、紫外透射仪、TAE电泳缓冲液、EB、加样缓冲液、琼脂糖等实验目的：学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 基本要求：（1）掌握电泳基本知识（2）掌握琼脂糖凝胶的制备方法（3）掌握DNA的定量检测分析。实验原理及步骤：DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带

7、负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告15%考核要点：琼脂糖凝胶的配制、待测样品的上样处理 期末测试5%合计20%5-8学时实验三、PCR扩增制备目的基因分组要求：4-5人每组1仪器设备： PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统、DNA模板、引物1、引物2、dNTP、Taq酶、Eppendorf管等2 实验目的：掌握PCR反应的基本原理和实验技术

8、。 3 基本要求： （1）学会PCR反应体系的制备方法（2）学会PCR仪使用.4 实验原理及步骤：多聚酶链式反应类似DNA分子的天然复制过程。在待扩增的片段两侧和 与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。5 考核方式与权重比例考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告15%考核要点：PCR原理、PCR反应体系的设定 期末测试5%合计20%9-12学时实验四 大肠杆菌感受态的制备及转化 分组要求：4-5人每组1 仪器设备：超净工作台、恒温摇床、1.5mL塑料离心管、微量加样器、台式高速离心机、水浴锅、电泳仪、电泳槽2 实验目的：学习大肠杆菌转化

9、的方法和技术3 基本要求:1、 掌握感受态制备的原理和方法；2、 掌握细菌转化的步骤4 实验原理：细菌细胞只有处于感受态才容易吸收外来的DNA分子。因此，重组DNA分子在转化细胞之前，受体细胞首先要处于感受态。获得大肠杆菌感受态细胞的方法是用冰冷的cacl2 处理对数生长期的细菌，然后进行短暂的热刺激处理，这期间细菌就能够摄取各种不同的外源DNA分子。由于载体质粒上有抗生素抗性基因等筛选标志，因而可以通过在培养基中添加抗生素来筛选和鉴定转化子。5 考核方式与权重比例考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告15%考核要点：感受态细胞制备的原理、转化的步骤及注意事项。期末测试5%合计2

10、0%13-16学时实验五：重组DNA的酶切鉴定1 分组要求：4-5人每组2 仪器设备：超净工作台、恒温摇床、1.5mL塑料离心管、微量加样器、台式高速离心机、水浴锅、电泳仪、电泳槽实验目的：了解限制性内切酶的类型及特点，学习限制性酶切原理，掌握用两种不同的限制性内切酶切质粒的方法。基本要求:3、 掌握限制性内切酶酶切原理4、 掌握双酶切质粒的方法5 实验原理：重组质粒是用EcoRI和Xhol酶切质粒DNA和PD-I基因后连接的，所以用EcoRI和Xhol酶切后，出项两条DNA片段，在1%的琼脂糖凝胶电泳上应出现两条带，一条区带与空载的质粒一致，另一条与外源基因PD-I区带一致。6考核方式与权重

11、比例考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告5%考核要点：限制酶的使用注意事项、限制酶实验体系期末测试5%合计10%17-18实验六、凝胶中DNA片段的回收与纯化1、仪器设备：台式离心机、水平电泳仪、-20°C冰箱、低熔点琼脂糖、DNA回收试剂盒、苯酚等2、实验目的：掌握低熔点琼脂糖法、苯酚法等回收和纯化目的DNA片段的方法和技术。3、基本要求：学会低熔点琼脂糖法回收和纯化DNA片段技术，得到纯化的目的基因片段。4、实验原理及步骤：传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收。现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。5、考核方式与权重比例考核方式评价权重备注平时实验操作、实验结果、实验报告5%考核要点：凝胶的切割、DNA的纯化期末测试5%合计10%四、本课程的考核评价与权重比例汇总实验的项目知识能力素质质粒DNA的提取5%4%4%琼脂糖凝胶电泳4%10%5%PCR技术扩增DNA片段10%10%6%大肠杆菌的转化4%8%2%重组质粒DNA的酶切鉴定5%8%5%凝胶中DNA片段的回收与纯化3%5%2%合计3