TAP与急性胰腺炎

1、TAP与急性胰腺炎 胰蛋白酶原活化，然后相继激活其他胰酶，并导致胰腺自身消化是AP发病的关键。胰酶活化的确切机制至今未明，TAP是胰蛋白酶原活化降解产物，可作为研究AP胰酶活化的重要工具。1.TAP的生物学特性1.1TAP的生成和代谢 在正常生理条件下，小肠腔内的肠激酶分解胰蛋白酶原，从而激活酶原。激活过程中胰蛋白酶原氨基端释放的活性肽包含有天冬氨酸（Asp）和赖氨酸（Lys）序列1。AP时胰蛋白酶原在胰腺实质内活化，胰蛋白酶生成的同时也有TAP的释放2。TAP即Asp-Asp-Asp-Lys序列，分子量为600kD。在生理条件下，小肠消化期产生的TAP被释入近端小肠，而AP时所产生的TAP则

2、通过胰腺渗入腹腔，进入血液循环再随尿排出。TAP不具胰蛋白酶活性。1.2TAP的检测 Hermon-Taylor等最早合成了TAP并生产出具有高度特异性的TAP抗体。TAP抗体能识别TAP的C端与TAP结合而不与胰蛋白酶原结合。运用这种抗体学者们发现了定量检测TAP的放射免疫法，酶联免疫吸附试验（ELISA），应用TAP，而不是胰蛋白酶作为胰蛋白酶原激活的指标，因TAP具有以下特点3：（1）热稳定性；（2）无内在化活性；（3）与蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶自动活化无关。2.TAP用于胰酶活化的研究2.1不同AP实验模型的胰酶活化 Foitzik等4用小鼠CDE（无胆碱乙硫胺酸饮食）模型、大鼠十二指肠

3、闭襻模型以及大鼠胰胰胆管结扎加蛙皮素刺激诱发了不同严重程度的AP，在不同时间测定胰腺组织、血浆中TAP浓度，结果均见升高。用蛙皮素、蛙皮素和胆管内灌注GDOC（糖脱氧胆酸）、蛙皮素和GDOC及肠激酶诱发出不同严重程度的AP，TAP浓度与AP严重程度密切相关，且可用于预测并发症的发生5,6。Werner等7，8通过动脉插管给予酒精代谢物FAEEs或酒精诱发了大鼠类似胰腺炎的损伤。TAP升高。最近，Mithofer等9证实缺血可单独激活胰酶启动AP，胰酶活化、TAP升高明显发生在缺血导致的胰腺细胞坏死之前。这些动物模型从不同程度模拟了人类AP，为胰蛋白酶原激活学说提供了更多的证据，印证了胰酶活化是

4、动物及人类AP早期病理生理的共同机制。2.2胰酶活化的机制 目前关于AP时细胞内胰酶活化机制有两种学说：（1）融合学说 溶酶体水解酶（LH）和消化酶原（D2） 在胰腺细胞内相互融合，溶酶体水解酶组织蛋白酶B激活胰蛋白酶原10。(2)自动活化学说 胰蛋白酶原介导的自动活动Bhagat等11用蛙皮素诱导大鼠AP，对胰腺组织蛋白酶B和TAP进行免疫细胞化学定位。0.5小时在胰腺细胞核顶侧的小囊泡或空泡内，TAP和组织蛋白酶B均被染成阳性。提示组织蛋白酶B和TAP在早期即共存或融合在小囊泡或空泡内。Klonowski-Stumpe等12将最新分离的胰腺细胞与超生理浓度的蛙皮素一起孵育，可明显地激活酶原

5、，使TAP显著升高。如预先给予胰蛋白酶抑制剂Fut-175，则明显减少TAP的释放，而组织蛋白酶B抑制剂E-64和NCO-700则无此作用。他认为胰蛋白酶原自动活化是酶原活化的主要机制。Steel等13认为可能E-64的细胞渗透力不强，导致未能真正地抑制组织蛋白酶B对酶原的激活。E64D相比E64具有更强的细胞渗透性，可完全抑制组织蛋白酶B的活性，阻止蛙皮素诱导的胰酶活化14，有力地支持了融合学说。2.3胰酶活化时间及其定位 虽然胰酶活化启动AP的观点已被广泛接受，但是胰腺酶活化的具体定位仍不清楚。Luthen等15运用多克隆抗TAP抗体对蛙皮素诱导的大鼠AP胰酶活化进行免疫组化定位。注射蛙皮

6、素（50g/kg）后1小时，在腺泡细胞顶端观察到胰蛋白酶原的激活；二次注射皮素（50g/kg）后4小时，胰腺外分泌组织细胞内TAP标记更明显，分布更均匀，而间质、胰管及周围TAP呈阴性。上述实验第一次为胰酶的细胞内活化理论提供了直接的形态学证据。Mithofer等16给予5g/kg?h蛙皮素3小时诱发大鼠急性水肿型胰腺炎（AEP），利用亚细胞分离技术观察到，注射蛙皮素后1小时，TAP主要定位于消化酶原（D2）部分，随后扩展到细胞内其他部分。实验过程中D2部分组织蛋白酶B活性不断升高 。3小时后总胰蛋白酶原含量增至143%，且间质内出现大量酶原聚集。此实验再次印证了胰酶首先在胞内活化，然而大量未

7、激活的酶原可到达胰腺间质导致细胞外胰蛋白酶原池的生成。最近，Hartwing等17发现AP时存在于间质的大量胰蛋白酶原可通过门脉循环及淋巴循环引流，静脉给予肠激酶以激活胞外酶原，导致AEP转化为急性坏死型胰腺炎（ANP）。因此，细胞外酶原活化可能是ANP发病的基础，且可能与全身并发症有关。由此可见，TAP作为胰蛋白酶原激活的分子标志物，为动态观察AP胰酶活化的定位提供了一种可靠的工具。3.Ca2 超载与TAPCa2 超载在AP发病中的作用是目前研究的热点。1995年Ward等18提出假说：各种致AP因子引起胰腺细胞内Ca2 ；持续升高，使胰腺细胞异常从而导致AP的发生，其机制有：（1）阻止钙/

8、钙调蛋白信赖性蛋白激酶失活，使细胞不能对进一步刺激产生反应；（2）激活降解的Ca2 依赖性蛋白酶、磷脂酶A2、核酸内切酶；（3）导致线粒体膜电位的崩溃从而使ATP耗尽；（4）对细胞骨架的破坏；（5）致胰蛋白酶原自动活化19；（6）细胞内胰酶活化对Ca2 有信赖性。Mithofer等20在大鼠左颈动脉内注射200mg/kg氯化钙（2分钟内），导致细胞内Ca2 快速持续升高而激活胰蛋白酶原，TAP早期即升高且维持24小时，而局部腺细胞明显坏死出现在24小时。可见TAP早期升高是高钙激活胰酶的原发结果而坏死腺泡胰酶活化所致。而Frick等21将分离的胰腺细胞与离浓度氯化钙液5.0mmol/L共同孵育

9、，结果示单纯细胞外Ca2 增高不能导致ATP的升高。若加入大剂量蛙皮素或卡巴胆碱则使胰酶活化增加1倍，胰蛋白酶原活化先于胰腺细胞的损伤。酒精性AP模型中，Ca2 拮抗剂亦明显改善胰腺损伤的程度、减少胰腺和血中TAP值。有学者认为胰腺微循环障碍可导致细胞钙超载，Ca2 超载可引起胰蛋白酶原自动活化而导致AEP向ANP转变22。综上所述，Ca2 超载不仅参与了AP发病的早期活动，而且对AEP向ANP转化起重要作用。4.TAP检测对Asp的早期预测4.1实验性AP 大量动物实验证实：胰腺损伤的严重程度随TAP产生的增加而加重23。Schmidt等24测定不同严重程度的大鼠血、尿中TAP。血、尿TAP

10、浓度值得早期准确预测预后，且TAP升高与胰腺细胞坏死和胰腺内出血高度相关。最近，他们又发现ANP大鼠腹水中TAP值能准确预测ANP晚期组织病理学病变。这些实验为临床TAP的研究提供了理论依据。4.2临床研究 Gudgeon等25运用放免法首次测定了50例不同病因的AP患者的尿TAP值变化。入院时尿TAP值2 nmol/L早期预测重症Asp的特异度为90%，敏感度为80%，准确度为87.3%，且高于2nmol/L的患者75%出现了严重的并发症；入院后24小时尿TAP最高值2 nmol/L对AP预测的特异度敏感度及准确度分别为85%、80%和83.6%，在早期预测Asp方面，尿TAP法优于Imri

11、e多因素评分系统及CRP值检测。为了排除肾功能的影响，Heath等26从发病时面 非入院时分几个时段取样，对尿TAP/Cr进行监测。尿TAP/Cr的中位数峰值在首发症状后1224小时之间，且重症AP组明显高于轻型组。晚近，Perejaslov等27用ELISA检测了35例AP患者的血TAP浓度。据Ranson评分标准，35例中13例为轻型，22例为重型。入院第一天血TAP浓度阈值10.5 nmol/L早期预测ANP的敏感度为81.2%，特异度为69.2%。动物实验业已证实ANP时胰腺微循环障碍可使胰腺产生的TAP进入血循减少，从而影响了血、尿中TAP值，因此提出检测腹水中TAP更能准确地反映胰

12、酶活化的数量28。Heath等29对22例AP病人在首发症状后23小时内（1458小时）行腹腔抽吸术。腹水中TAP诊断胰腺坏死的敏感度为89%，特异度为85%，有助于外科手术病人的选择。一般腹穿时间以48小时或更迟一些为宜，这样可使一些轻度AP患者免受检查的痛苦。目前对比增强CT是诊断胰腺坏死的最好方法，相比之下，TAP检测更方便 、可行。因此应用TAP检测来诊断胰腺坏死有很重要的现实意义。5.小结TAP作为胰蛋白酶原激活的分子标志物，对胰酶活化机制的研究直到了推动作用。另外，动物及临床实验均证实TAP对Asp的早期预测有较高的价值，TAP有希望成为临床AP病人的一项常规检查指标。但是因临床研

13、究例数的限制，应设计大组病例临床研究去评估和确定其应用价值。参考文献1.Hurley PR et al.J Immunol Methods,1988;111(2):195-2032.Karanjia ND et al.Pancreas,1993;8(2):189-1953.Mithofer K et al.Anal Biochem,1995;230(2):348-3504.Foitzik T et al.Surgery,1994;115(6):698-7025.Schmidt J et al.Gastroenterology,1992;103(3):1009-10166.Fernaadez-d

14、el castillo C et al.Pancreas,1992;7(3):263-2707.Werner J et al.Gastroenterology,1997;113(1):286-2948.Werner J et al. Gastroenterology,1998;114(4 Pt 2):A5099.Mithofer K et al.Ann Surg,1995;221(4):364-37110.Steel ML et al.AJR,1995;164(4):811-81411.Bhagat L et al. Gastroenterology,1998;114(4 Pt 2) :A44

15、112.Klonowski-Stupe h et al.Pancreas,1998;16(1):96-10113.Steel ML et al.Pancreas.1998;17(1):31-3714.Saluja AK et al. Gastroenterology,1997;113(1):304-31015.Luthen P et al.Pancreas,1998;17(1):38-4316.Mithofer K et al.AM J Physiol,1998;274(1 Pt 1):G71-G7917.Hartwig W et al.Pancreas,1998;17(4):4318.War

16、d JB et al.Lancet,1995;346(8981):1016-101019.Leach SD et al.Scand J Gastroenterol,1992;27(Suppl)192:29-3820.Mithofer K et al. Gastroenterology,1995;109(1):239-24621.Frick TW et al.Gut,1997;41(3):339-34322.Pu QF et al.Natl Med J China,1999;79(2):143-14523.Nakae Y et al.Pancreas,1995;10(3):306-31324.Schmidt J et al.Dig Dis Sci,199