叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

1、沏尹上挈实验报告; 课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型： * I-1 实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定*+; 姓名：专业：学号：*+*1 同组学生姓名：指导老师：* 1 1实验地点：实验日期:订、实验内容和原理四、操作方法与实验步骤六、实验结果与分析一、实验目的和要求线j 三、主要仪器设备 :五、实验数据记录和处理r七、讨论、心得、实验目的和要求1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素 a和b的方法及其计算。、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析

2、。原理如下:1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙酉1或80%勺丙酮提取。2、皂化反应。叶绿素是二竣酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与 有机溶剂中的类胡萝卜素分开。COOCHCOOMoONMg + 2KOHC32Hl30ON4Mg+ 2KOH +CH3OH +C20H39OHCOOCH9COO3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素吓咻环中的 Mg+T依次被H+K Cu+< 代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )褐色绿色4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。5、定量分

3、析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中 645和663用 于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值之间有如下的关系：OD=Ca*kai+G*k bi OD=Ca*ka2+Cb*k b2查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如 下。波长/nm比吸收系数k叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将数值代入式子得：OD663=82.04*Ca+9.27*Cb OD645=16.75*Ca+45.60*Cb经整理后，得至U式子：Ca=

4、0.0127 OD663- 0.00269 OD645cb=0.0229 OD645- 0.00468 OD663三、主要仪器设备天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等四、操作方法与实验步骤1、定性分析：鲜叶5g+95%30m 1（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。皂化反应（3ml）:力口 KO傲片剧烈摇均，加石油醴5ml和H2O 1ml分层后观察取代反应（1）:加醋酸约2ml,取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。取代反应（2）:鲜叶2-3cm2,加Ac-AcCu 20ml加热。2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油

5、醴溶液一稀释（470nm OD 0.5-1）反复用石油醴粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素（盐）一稀释（663nm OD 0.5-1）两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3、叶绿素定量分析：鲜叶0.1g,力口 1.9mlH2O,磨成匀浆，各取0.2ml力口 80殉酮4.8ml,摇匀，4000转离 心3min,上清液在645, 652, 663测定OD计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。五、实验数据记录和处理1、定性分析：观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。皂化反应 （3ml） ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收

6、红光和蓝紫光。取代反应（1）:加醋酸约2ml,变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色, 为铜代叶绿素。2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：图 1图 2图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。图二在450nm以及475nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根 据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。3、叶绿素定量分析:将数值代入式子，计算得:波长/nm645652663OD第一组0.0660.0940.175第二组0.0

7、680.0930.172平均0.0670.09350.1735Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645=12.7*0.1735-2.69*0.067=2.02 mg/LCb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=22.9*0.067-4.68*0.1735=0.722 mg/LCT (mg/L) = Ca+ Cb =2.74 mg/LChla 含量(mg/g.FW)= (Ca(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2=1.01 mg/g.FWChlb 含量(mg/g.FW) =(Cb(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2

8、=0.361 mg/g.FWChl 总含量(mg/g.FW) =(CT(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2=1.37mg/g.FW六、实验结果与分析1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时 加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。2、从定量实验所得数据的计算结果来看， 实验所用的叶片中， 叶绿素 a 的含量大约是 叶绿素 b 的三倍左右。3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是以下几个原因造成的： 1.研磨的充分程度不同 2. 所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别七、讨论、心得1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？叶绿素有基态（ G） ， 第一单线激发态（ E1） 和第二单线激发态（ E2） 及第三线态（ E3） ，光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2,而红光能量小，只能使其跃迁到E1,故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。2、为什么可用皂化后的叶