植物氨态氮测定

1、植物组织氨基酸含量的测定（改良的菊三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成 氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋 白质。測定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的药三酮比色法。a氨基酸与水合葩三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相 应的a 酮酸，酮酸进一步脱竣变成醛，水合菊三酮则被还原，在弱 酸环境中，还原型菊三酮，氨和另一分子水合菊三酮反应，缩合生成 蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在5 80nm波长下測定吸光值。本 实验中在菊三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服药 三酮的不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、

2、三角瓶、容量瓶、移液管、天 平、沸水浴锅、可见分光光度计三、试剂1. 10% 醋酸（100mL）2. 1%抗坏血酸（100mL）35ug/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0. 005g定容至1000mL）4. pH5.4醋酸缓冲液：8. 8mL 0. 2mol/L醋酸（冰醋酸1155mL 稀释至1 OOOmL）加41.2mL 0. 2mo I /L醋酸钠（醋酸钠1 6. 4g 或三水醋酸钠27. 2g 配成10OOmL） o5水合菊三酮试剂：11 g菊三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇， 摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mL pH5. 4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，

3、冰箱保存，适用期限 10天。四、操作步骤1标准曲线的绘制以下表所示量从5 u g/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液 并在每个试管中加蒸馅水至2mL,对照仅加2mL 蒸镭水，后在 各试管中加入3mL水合菊三酮试剂和0. 1mL 1 %抗坏血酸，摇 匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分 钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL,在波长580nm处 測吸光值，以氨态氮浓度（口 g/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘 制标准曲线。试管号6712345试剂(m L)00.20. 4081.21.6 1.8氨态氮浓度00. 51 234(U g/mL)2. 称取0. 5g新鲜植物材

4、料，放入研钵中，加入5mL 1 0%醋酸, 研磨后以蒸镭水稀释至WOmL，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤 下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。3. 从剩下的滤液中取2mL放入试管中，加3mL水合菊三酮试剂和0.1mL抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馅水代替）的试管加热。4. 取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色菊三酮试剂被氧氧化而 褪色，菊三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更 加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至1 OmL ,混匀。在 波长580nm处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公 式计算氨态氮含量。（ioxiooxc）xdoog样品中的氨态氮毫克数） xioonC:比色液中氨态氮浓度（ug/mL）n:样品重量（g ）1 00：分析溶液总体积（mL）5. 实验结果与分析氨态氨含量标曲：序号1234567氨态氮浓度00.51230. 48450D值0 152 0 23 70.3180. 41540. 6070. 718方程:y=0. 1073X+0 181测定样品液的OD580值为：0.939标曲查得：0. 9 39=0.10730-0. 1 8 1C=1 0.38 ug/mL(0. 1 X 1 0X10. 3 8 u g/