抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究

1、抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究*         06-03-31 14:13:00     作者：刘贵建 许淑珍    编辑：studa9ngns关键词： 肠球菌     【摘要】  目的  深入研究肠球菌耐药性的产生机制，指导临床合理用药。方法  采用一步诱导法，对8株粪肠球菌、2株屎肠球菌和9株粪肠球菌、1株屎肠球菌进行四环素和左氧氟沙星诱导性耐药试验。对诱导出的菌株

2、用琼脂稀释法测定药物敏感性；用PCR法检测四环素耐药基因tetM、tetL，用PCR法扩增gyrA、parC基因后测定DNA序列。结果  10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的四环素耐药株。耐药株的MIC分别为16128g/ml，与原株（MIC0.25g/ml、2g/ml）比较，增加了16512倍。在1株实验菌的诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL耐药基因，另一株实验菌株的诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM耐药基因；10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的左氧氟沙星耐药株。诱导耐药株的MIC分别为1664g/ml，与原株（MIC 2g/ml、2g/ml）比较，增加了832倍

3、。GyrA的QRDR内的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR内的第80位的氨基酸均发生了改变。结论  一步法抗菌药物诱导性耐药试验的结果表明，肠球菌可在高于耐药MIC浓度的抗菌药物短期作用后获得耐药性。    【关键词】    肠球菌  抗菌药物  诱导性耐药  抗菌药物压力    Laboratory study of antibacterial agents on enterococcus induced resistance   

4、;      【Abstract】  Objective  The purpose of the present research was to study on the emergence mechanism of enterococcal resistance to a variety of antibacterial agents，and to guide the selection and use of antimicrobial agents in clinical practice.Methods  E

5、ight of faecalis enterococcus and two of faecalis enterococcus，nine of faecalis enterococcus and one of faecium enterococcus were selected to performed experiments on induced resistance to tetracycline、levofloxacin respectively by one-step method.The susceptibility of the induced strains resisitant

6、to tetracycline、levofloxacin was measured by determining the MIC using agar dilution method. The tetM and tetL gene in the induced strains were detected by PCR， gyrA and parC gene were amplified by using PCR，then the nucleotide sequence of two genes were analysed.Results  Some strains stably re

7、sistant to tetracycline were obtained from 2 of 10 test strains，the MICs of these laboratory resistant strains were 16128g/ml.with 16-fold512-fold increase when compared with parental strains (MIC 0.25g/ml、2g/ml， respectively). The gene of tetL was detected in the plasmid DNA of one test strain and

8、its laboratory resistant strains. The gene of tetM was detected in the chromosome DNA of the laboratory resistant strains from another one test strain. Some strains stably resistant to levofloxacin were obtained from 2 of 10 test strains.The MICs of the laboratory stains were 1664g/ml，with 832 times

9、 higher than that of the parental strains (MIC 2g/ml、2g/ml respectively). Neucleotide  sequence analysis and comparison of the derived amino acid sequence revealed that GyrA had a substitution at position 83 and 87 in laboratory resistant strains.The alterations in ParC at position 80 were obse

10、rved in all laboratory resistant strains.Conclusion  The results of in vitro experiments on enterococcal strains for induced resistance to tetracycline and levofloxacin，which were performed by one-step method，show that acquired resistance could be occurred when exposuring them to high level of

11、some antibacterial agents for short term.     【Key words】  enterococcus  antibacterial agents  induced resistance  antibacterial pressure    近年来，肠球菌作为一种引起医院感染的重要病原菌已经引起了医学界的广泛关注。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌1。    肠球菌不仅具有天然耐药性，而且更易

12、被诱导产生新的耐药性。Tankovic报告对环丙沙星耐药的肠球菌由19871989年期间的不到2%增加到19911993年间的14%以上，而且是由该类药物在临床上的应用增加所致2。在瑞典Huddinge医院，对喹诺酮耐药的肠球菌由1994年的11%增加到1997年的25%3。而国内19972001年期间临床分离的肠球菌对环丙沙星耐药率分别为粪肠球菌44.2%，屎肠球菌70.7%4。在美国，由于万古霉素的使用，19891993年间肠球菌对万古霉素的耐药率增加了20倍。这些统计学临床资料已经显示，抗菌药物的临床应用造成的药物选择性压力可能是引起肠球菌耐药性的产生与扩散的重要原因之一。 &

13、#160;  为深入探索肠球菌耐药性的产生和发展，本课题就此进行了部分抗菌药物的实验研究。    1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  菌株  实验菌株TE1TE10（TE3、TE9为屎肠球菌，其它为粪肠球菌）用于四环素诱导性耐药试验。实验菌株LE1LE10（LE2为屎肠球菌，其它为粪肠球菌）用于左氧氟沙星诱导性耐药试验。质控菌株为粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC 51299。    1.1.

14、2  抗菌药物  左氧氟沙星（LEV，5g/片）、四环素(TCY，30g/片)药敏纸片购自Oxoid公司。四环素、左氧氟沙星粉剂购自中国生物制品研究所。    1.1.3  试剂  心脑浸液、M-H琼脂，购自BECTON-DICKINSON公司。Vitek细菌鉴定卡及药敏鉴定卡购自法国生物梅里埃公司。PCR引物由赛百盛公司合成。四环素耐药基因tetM引物为5-GAC ACG CCA GGA CAT ATG G-3， 5-TGC TTT CCT CTT GTT CGA G-3；四环素耐药基因tetL引物为5-ATA AAT T

15、GT TTC GGG TCG TTA AT-3，5-AAC CAG CCA ACT AAT GAC AAT GAT-3；DNA消旋酶gyrA引物为5-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3，5-AAT TTTACT CAT ACG TGC TTC GG-3；DNA消旋酶parC引物为5-AAA CCT GTT CAG CGC CGC AT-3，5-TCG GTG TAA CGC ATT GCC GC-3。    1.1.4  仪器设备  Vitek AMS-60全自动细菌鉴定及药敏系统（法国生物梅里埃公司）。AG-96

16、00 AMPLISENSOR MINILYZER PCR扩增仪（美国）。    1.2  方法    1.2.1  实验菌株的选择  依据细菌鉴定及MIC结果，最终选择对四环素敏感的8株粪肠球菌和2株屎肠球菌（MIC 0.254g/ml）作为四环素诱导性耐药的实验菌株；对左氧氟沙星敏感的9株粪肠球菌和1株屎肠球菌（MIC 0.52g/ml）作为左氧氟沙星诱导性耐药实验菌株。    1.2.2  药物敏感性试验  琼脂稀释法参照2002年NCCLS推荐的方法

17、进行操作及判读结果，同时测定粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC 51299的MIC进行质控。    1.2.3  四环素诱导性耐药试验  采用一步法。参照文献5及肠球菌对四环素耐药的MIC界值，首先确定四环素诱导耐药试验的药物浓度为20g/ml、细菌接种量为107CFU/每个平板。将实验菌制备成1×108CFU/ml菌悬液，取100l菌悬液加入到含20g/ml四环素的BHI琼脂平板上，用无菌L形棒均匀涂布平板，35培养24h、48h、72h、96h、120h后观察结果，并记录生长的菌落数。取培养后生长出的菌落，纯培养后制备1

18、×108CFU/ml菌悬液，取100l菌悬液涂布接种新鲜制备的含20g/ml四环素的BHI琼脂平板，35培养1824h，观察有无细菌生长。在新鲜制备的及35分别放置了24、48、72、96和120h的含20g/ml四环素的BHI琼脂平板上，涂布接种100l 1×108CFU/ml粪肠球菌ATCC29212及实验菌悬液，于35培养1824h后观察有无菌落生长。对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性，用PCR检测tetL和tetM耐药基因。    1.2.4  左氧氟沙星诱导性耐药试验  采用一步法。参照四环素诱导性耐药试验，

19、首先确定左氧氟沙星诱导耐药试验的药物浓度为10g/ml。其余步骤基本同四环素诱导性耐药试验。此外，对部分诱导出的菌株的gyrA和parC基因扩增后，进行DNA序列分析。    1.2.5  诱导性耐药菌株的稳定性试验  将诱导的耐药菌接种在无抗菌药物BHI肉汤中，35培养，每24h转种一次，连续培养10代。然后进行药物敏感性测定。    1.2.6  耐药基因测定  碱裂解法制备质粒DNA、参照方法6制备染色体DNA。PCR反应体系100l，含模板DNA约0.2g，引物0.2mol/L，0.2m

20、mol/L dNTP，10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，2.5U TaqDNA聚合酶。耐药基因DNA测序：将gyrA、parC和部分实验菌株的tetL基因扩增产物经DNA纯化后送北京华大中生科技发展有限公司测序部进行DNA序列测定。测序结果对照基因库检索结果进行分析。    2  结果    2.1  四环素诱导性耐药试验结果    2.1.1  诱导性耐药培养结果  (1)实验菌TE5和TE8在48h12

21、0h培养过程中分别生长了131、87个菌落。TE1TE4、TE6TE7、TE9TE10实验菌株在120h培养过程中，无菌落生长。(2)将48120h生长的菌落再次以相同的菌量分别接种含四环素BHI琼脂平板，24h培养后菌落融合生长成菌膜。(3)在35已经放置了24120h的含四环素BHI琼脂平板上，分别接种了TE5、TE8和ATCC29212，24h培养后无肉眼可见的菌落生长。    2.1.2  诱导性耐药菌株的药物敏感性  随机选择的48h和72h生长出的诱导菌株全部为四环素单耐药株，与原株相比，TE5、TE8诱导株的MIC分别增加了645

22、12和1664倍。药敏结果详见表1。将诱导的耐药菌株在BHI肉汤中进行连续10天的传代培养后测定MIC，结果与传代前比较无明显改变。    表1  四环素诱导的菌株的耐药性注：TE521、TE522、TE821、TE822分别为实验菌株TE5和TE8的48h诱导耐药株；TE531、TE831、TE532、TE832分别为实验菌株TE5和TE8的72h诱导耐药株。     2.1.3  诱导性耐药菌株耐药基因的检测  对原株、耐药菌株TE521，TE821；TE531，TE831；TE532，TE832，经

23、PCR扩增检测四环素耐药决定子tetL、tetM。结果在 TE5及诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL，在TE8诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM。对TE5、TE521的tetL基因进行了测序，其结果与Genbank中的序列同源性为99%，TE5与TE521的序列完全一致。    2.2  左氧氟沙星诱导耐药性试验结果    2.2.1  诱导性耐药培养结果  (1)实验菌株LE1，LE5在48h120 h培养过程中分别生长了54、48个菌落。LE2LE4、LE6LE10实验菌株在120h培养过程中，无菌落生长。(2)48120h生长的菌落再次以相同的菌量接种含左氧氟沙星BHI琼脂平板，24h培养后生长成菌膜。(3)在35已经放置了24120h的含左氧氟沙星BHI琼脂平板上，分别接种了1×107CFU/平板的LE1、LE5和ATCC29212，在24h培养后无肉眼可见的菌落生长。    2.2.2  诱导性耐药菌株的耐药性  诱导获得的耐药菌株全部为左氧氟沙星单耐药菌株，与原株相比，LE1、LE5诱导耐药株的MIC分别增加了1632倍和16倍。将诱导的耐药菌株在BHI肉汤中进行