肝糖原提取,定性以及定量实验

1、南方医科女曇生物化学实验报告姓名：张子荣学号:3150901080专业年级：2015级临床医学组另1：第五实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验日期实验地点 第五实验室合作者张林燕指导老师 何肖娟评分教师签名批改日期格式要求： 正文请统一用 ：小四号，宋体， 1.5倍行距；数字、英文用 Times NewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器

2、。4. 熟练运用溶液混匀的各种方法。5. 正确掌握溶液转移的操作。6. 正确操作使用分光光度计。二、实验原理1. 肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从 而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用 95% 乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。2. 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。CuS

3、O+ 2NaOH = NazSQ + Cu(OH) 2 J2Cu(OH+ C 6H2Q = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H 2O2CuOH = HO + CU2O (红色)Cu(OH) = H2O + CuO (黑色)3. 肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物一一5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。 该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10100 mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正 比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即 可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳

4、定，故在显色之前，肝组织 先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意仪器及试剂：1. 仪器:(1) 普通离心机，室温-100 C恒温水浴箱(x2)，722型分光光度计，精度为10mg级电子天平(2) 剪刀、镊子、研钵(3) 试管架，离心管，试管(4) 刻度吸量管(2ml ,5ml ), 1000卩l微量可调取液器(5) 100ml容量瓶(6) 白瓷反应板2. 试剂:鸡肝、95聽醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCI、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KO溶液、标准葡萄糖液(50mg/

5、L)蒽酮显色剂实验方法及步骤：1. 肝糖原的提取鸡肝约1.5 g，剪碎|+ 5%CC3COOH 1 ml研磨至乳状|+ 5%CC3COOH 3 ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心 3分钟(4000 r / min )沉淀(弃去) 上清(取3.5-3.8ml )+等量的95%L醇，混匀，静置10分钟1 离心 5分钟(4000 r / min )上清(弃去)沉淀+蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml加碘试剂2滴糖原溶液2滴呈色对比加碘试剂2滴+浓HCI 5滴（250微升）水浴15分钟，冷却+ 50%NaOH 滴（ 250 微升）糖原水解液2滴（100微升）糖I+班氏

6、试剂4滴（200微升）混匀沸水浴2分钟，观察变化注意事项:1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%L醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液, 比重大于95%L醇，溶液分成两层。加之上清液已 4ml多，加上等量乙醇，总量接近 9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现 蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20个以下（通 常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，

7、加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。2.肝糖原定量测定鸡肝0.15 g+ 30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作:试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0标准匍萄糖溶液1.0糖原提取液1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min,冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空肝组织重0（ g） X誥X “白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算:肝糖原（g/100g肝组织）=勞定X 0.05 X注：由于我们组样品是稀释2倍的，所以后

8、来结果要X稀释倍数四、结果与讨论： 结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。（一）实验现象以及数据：实验一：肝糖原提取，鉴定实验1. 当把1.5g的鸡肝加入1ml5%勺CCbCOO研磨至乳状，在加入3ml5%勺CCbCO0研磨至肝匀浆转入试管后，可以发现试管液呈现乳黄色浑浊。2. 加入离心管离心三分钟后，试管形成三个层，由上到下分别是：乳黄色的固体层（脂肪脂质等物质）；稍微浑浊呈白色的溶液层；乳黄色固体层脂肪等物质溶液不溶性杂质等物质3. 吸取上图中的溶液层溶液加入等量乙醇溶解再次离心后，可以看见此次的溶液形成乳白色沉淀，而且相比于第一次离心，此次离心形成的液体

9、更加澄清5.在呈色对比反应中，加入糖原溶液的呈现红褐色。6.取充分水解后的糖原水解液2滴与班氏试剂均匀，沸水浴 2分钟后，使溶液变为砖红色实验二：肝糖原定量实验鸡肝仅微量溶解;1. 0.15g的鸡肝加入KOHS液后并没有明显的变化,KOH呈现的深橘黄色浑浊溶液,但是也有少量的组织并没有溶解，而是悬浮状态,没有像其他组那样出现明显的分2. 100摄氏度水浴10分钟后可以看见鸡肝大量溶于层现象;3. 在转入100ml容量瓶时，可以发现一开始含有样品的溶液呈现深橘黄色，随着不断地加水润洗，溶液颜色由深橘黄色变为浅黄色，最后变为浅白色。4. 在最后进行糖原的测定时，在用刻度吸管加入2.5ml的蒽酮溶液

10、时，空白管剧烈发烫，溶液颜色逐渐变为黄色；标准管的颜色由无色变为绿色，试管发烫；样品管的颜色由原来的轻微白色逐渐 变为深绿色甚至有点偏蓝 的趋势。由于样品管糖原浓度过高，所以按照方法稀释2倍后，进行了 10分钟的100摄氏度水浴保温，得到的实验结果如下:标准管（水浴后）样品管（稀释2倍后水浴）样品管（未稀释未水浴）深绿色空白管（水浴后）浅黄色绿色浅蓝5. 将空白管在620nm处的A值设定为0，测得标准管、样品管的 A值如下:编号空白管标准管样品管（稀释2倍）100.5850.696200.5860.686300.5860.678平均值00.5860.687肝糖原（g/100g肝组织）=A标|X

11、 0.05 X肝组织重（g） X誥X小X稀释倍数（二）结果以及讨论：由以上数据可以得知，稀释2倍后的样品液A值为0.687,标准管为0.586，由以上公式计算：肝糖原(g/100g 肝组织)二0687 X 0.05 X I00 X卫0 X 1.11 X 2 -8.675 (g/100g)0.5860.151000分析以及结果讨论：1. 在鸡肝糖原的定性分析中，即 呈色反应中，样品溶液加入碘试剂后呈现明显的红褐色，说明样品液含有糖原； 在样品液水解液与班氏试剂反应中，使溶液呈现砖红色；说明水解液含有葡萄糖（还原性糖）综上，鸡肝中含有丰富的糖原。2. 在鸡肝糖原的定量实验中，我们组所得的肝糖原含量实验数据为8.675g/100g，而正常情况下为2-3g/100g，明显偏高。但在操作过程中称量0.15g鸡肝，加入KOH水浴, 加入蒽酮（换用加样枪结果依旧）均不