紫外可见光谱指纹图谱结合化学计量学鉴别不同焙炒度的中粒种咖啡

1、紫外可见光谱指纹图谱结合化学计量学鉴别不同焙炒度的中粒种咖啡董文江1,2,3， 王凯丽1,2,3， 谷风林1,2,3， 陆敏泉1,2,3， 赵建平1,2,3 *1 中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南万宁 5715332 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南万宁 5715333 国家重要热带作物工程技术研究中心，海南万宁 571533）摘 要 采用紫外可见光谱指纹图谱结合多元数据分析建立一种可快速鉴别不同焙炒度中粒种咖啡的方法，考察不同的光谱前处理方法对样品分类结果的影响，比较不同的模式识别方法对样品的鉴别结果。结果表明：一阶导数处理被选为最优的前处理方法，大部分样品能够在主成分分

2、析（PCA）和系统聚类分析（HCA）中按各自特性聚为一类，线性判别分析（LDA）的分类效果优于PCA和HCA；最小二乘向量机（LS-SVM）模型的预报结果优于偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和反传人工神经网络（BP-ANN），识别率和预报率均为100%。关键词 紫外可见光谱；焙炒咖啡；指纹图谱；多元数据分析中文分类号文献标识码咖啡饮料的质量与焙炒豆的化学组成密切相关，不同的生豆化学组成方式和采后加工条件（干燥、贮藏、焙炒和粉碎）导致焙炒豆的化学组成不同1。焙炒是咖啡加工过程中最重要的一个环节，在此过程中咖啡豆将发生显著的化学、物理、结构以及感官方面的变化；依据所需最终产品的特性不同，咖啡豆将

3、经历不同的温度-时间处理，从而形成不同风味的咖啡豆。众所周知，咖啡豆在焙炒过程中由于初始阶段的失水及碳水化合物的热解反应使其质量减小，同时由于内部气体（CO2和其它热分解产物）的形成使其体积显著增大，密度减小，形成焙炒咖啡豆的典型孔状结构2。用于评价焙炒豆质量的常用标准有失重、水分、颜色和风味的检测分析，其中前三个指标应用最为广泛而被用于考察焙炒后咖啡豆的变化。此外，气相色谱-质谱联用（GC-MS）、气相色谱-嗅觉测量法（GC-O）被用于考察咖啡焙炒后的风味变化，采用人工神经网络算法对特征风味成分与感官评价进行关联性分析3；Liberto等4通过采集咖啡豆的非分离顶空固相微萃取质谱联用（HS-

4、SPME-MS）轮廓数据作为监测咖啡焙炒度的标志物；Wei等5通过核磁共振光谱分析不同焙炒度咖啡豆的提取物以监测焙炒过程中风味成分的变化规律，控制焙炒反应过程。尽管上述分析方法在咖啡焙炒度质量控制上可靠性好，但通常它们对实验人员技能要求高、耗时、价格昂贵，且样品前处理繁琐甚至需要有机试剂，因此需要建立一种简单、快速的方法来实现不同焙炒度咖啡的鉴别。近年来，紫外可见光谱技术以其快速、易操作、廉价、样品前处理少而被用于食品、药品及化工行业的定性和定量分析中，化学计量学中的模式识别方法和多元回归分析在解析大量数据时优势明显，能够最大程度的从“海量数据”中提取有效信息，Sarbu等6采用紫外可见光谱和

5、高效液相色谱指纹图谱结合多元数据分析能较好的区分不同品种及亚种的猕猴桃和柚子；Boggia等7通过紫外可见光谱和化学计量学方法快速检测石榴汁中的填充果汁和蒸馏水；Pizarro等8利用可见光谱指纹图谱和物理化学指标结合多元数据分析可有效的区分不同地理来源的特级橄榄油。目前还没有采用紫外可见光谱指纹图谱鉴别不同焙炒度咖啡的相关报道，因此本文通过采集不同焙炒度中粒种咖啡样品的紫外可见光谱数据，经数据前处理校正基线漂移、光散射等影响后，采用无监督模式识别方法PCA和HCA，有监督模式识别方法LDA、PLS-DA、BP-ANN和LS-SVM对不同焙炒度咖啡样品进行鉴别，以校正集和预报集样品的识别率和预

6、报率为判别指标，优选最适的焙炒度预测方法，为咖啡的焙炒加工提供理论依据。_基金项目: 中国热带农业科学院院本级基本科研业务费项目（No. 1630012014017）。作者简介: 董文江（1985年），男，博士，助理研究员；研究方向：食品化学、化学计量学。*通讯作者（Corresponding author）：赵建平（Zhao Jianping）， Email：zjp-68068。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试材料咖啡鲜果采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所试验基地，九成熟，选择红色、无畸形、无病虫害的果实，共16个不同批次的样品，采用干法加工得到生咖啡豆，低温避光保存、备用。1

7、.1.2 主要仪器紫外可见分光光度计：SPECORD 250PLUS型（德国耶拿仪器有限公司），电子天平：AL204型（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），全自动超纯水系统：Master-s-plus UVF型（上海和泰仪器有限公司），咖啡豆烘焙机：PRE 1 Z型（德国probat仪器公司），咖啡豆研磨机：VTA 6S3型（德国MAHLKONIG仪器公司），快速水分测定仪：MB45型（瑞士奥豪斯仪器公司），色差分析仪：Xrite-SP62型（美国Xrite测色公司）1.2 方法1.2.1 焙炒豆的制备精密称取100.00 g生咖啡豆置入滚筒式咖啡烘焙机中焙炒，初始温度为180Co，保持恒定

8、火力6.5，焙炒时间分别为7.5 min（一爆结束）、9.5 min（二爆开始前）、11.5 min（二爆开始后1 min）,分别得到三种不同焙炒度的咖啡豆，浅度、中度和深度，选择范围较宽的焙炒度范围以确保校正模型的正确性和和适用性。每个样品采用相同的条件平行焙炒两次，共制备得到96个样品（16个样品 ´ 3个焙炒度 ´ 2个平行），样品编号为：浅度（No. 1-32）、中度（No. 33-64）、深度（No. 65-96），采用Kennard-Stone算法9将96个样品的2/3划分入校正集（60个样品），1/3划分入预报集（36个样品）。取20 g焙炒豆放入咖啡研磨机中

9、粉碎，制备粉末样品用于后续分析。1.2.2 失重、水分含量及颜色的测定失重：分别测定100.00 g生豆及其相应焙炒豆的重量，计算其差值，得到样品的失重。平行测定3次，取平均值。水分含量（%）：精密称取1.00 g粉末样品置于快速水分测定仪中测量，读数。平行测定3次，取平均值。颜色测定：精密称取1.80 g粉末样品放入样品测定槽中，石英玻璃压紧，测定的相关颜色指标包括L*、a*、b*、ho，光源为D62 (6500 K)，利用色差分析仪进行测定。平行测定3次，取平均值。1.2.3 咖啡液的制备精密称取8.25 g粉末样品加入250 mL圆底烧瓶中，加入150 mL蒸馏水，水浴回流提取15 mi

10、n。待冷却至室温后，过滤至250 mL棕色容量瓶中，备用。1.2.4 紫外可见光谱扫描咖啡液的紫外可见吸收光谱通过紫外可见分光光度计扫描得到，波长范围为200 nm-500 nm。光谱扫描前，精密移取50 mL上述滤液加入10 mL比色管中，蒸馏水定容至10 mL用于分析。所有光谱数据的波长分辨率为1.0 nm，通过WinASPECT PLUS软件导出，所得光谱数据矩阵为96个样品 ´ 311个波长。1.2.5 统计分析所有数据均采用MATLAB R2010a软件分析。2 结果与分析2.1 焙炒咖啡豆的失重、水分含量及颜色分析表1为焙炒咖啡的失重、水分含量及颜色相关指标的测定值，从表

11、中可看出，随着焙炒度的增加，咖啡豆的质量逐渐减少，失重增加，范围为12.24%-19.30%；值得注意的是，焙炒初始阶段的失重是由于水分的损失，焙炒结束阶段的失重是由于碳水化合物的热降解反应和微量化合物的热解反应。水分含量随焙炒度的增加逐渐减少，范围为1.66%-3.45%；在焙炒过程中，由于非酶褐变反应和热解反应，咖啡豆的颜色随着焙炒时间的增加逐渐加深，亮度（L*）逐渐减小，a*值和b*值逐渐减小，分别表示颜色由绿到红的表1 焙炒咖啡的失重、水分含量及颜色指标的平均值Table 1 Average values of roasting variables of roasted Robusta

12、 coffee samples类型失重（%）水分含量（%）L*a*b*ho浅度12.24±0.973.45±0.1737.62±2.1213.36±0.1627.36±1.2863.45±0.58中度16.02±0.712.02±0.0828.75±1.7212.33±0.3620.82±1.0658.81±0.24深度19.30±1.461.66±0.1622.45±1.729.36±1.7012.69±3.7555.70&

13、#177;0.84色彩变化和由蓝到黄的色彩变化；色彩角（ho）表示颜色由绿-黄区域（生咖啡豆颜色）到红-橙区域（浅度和中度焙炒豆）的变化，最后变化为棕褐色，ho逐渐减小。描述咖啡焙炒度的指标变化规律与文献报道相一致10,11，证实了试验方法和条件的可行性，即使在实验室小试条件下，也可以模拟工业生产过程以表征不同焙炒度咖啡样品的性能指标。2.2 紫外可见光谱数据的前处理方法比较图1 咖啡样品的紫外可见光谱图（a：原始数据；b：平均数据；c：标准正规变换（Snv）；d：多元散射校正（Msc）；e：一阶导数（1st derivative）；f：二阶导数（2nd derivative）Fig. 1 T

14、he UV-Vis spectra of coffee samples (a: Raw data; b: Mean data; c: Standard normal variate （Snv）; d: Multivariate scatter correction (Msc); e: 1st derivative; f: 2nd derivative在利用紫外可见光谱轮廓建立模型之前，通常需对光谱数据进行前处理以减小基线漂移、光路长短的改变、光散射等因素对分析结果的影响，本文选用多种前处理方法进行比较，包括标准正规变换（Snv）12、多元散射校正（Msc）13、Savitzky-Golay滤波

15、（9点，二阶多项式，一阶或二阶导数）14。以校正模型中预报集的相关系数（Rpre）和误差均方根（RMSEP）为判别指标，比较不同的前处理方法后模型的预报结果，一阶导数（1st derivative）被选为最优的前处理方法。图1 (a-f)分别为原始数据、平均光谱、Snv、Msc、1st derivative和2nd derivative处理后的样品在190 nm到500 nm的紫外可见光谱轮廓图，从图中可看出，不同焙炒度咖啡样品谱图极为相似，仅仅为在不同波长处强度的差异，光谱数据信息最丰富的区域在200-350 nm范围内，浅度焙炒样品的最大吸收峰在285 nm和325 nm附近，中度焙炒样品

16、的最大吸收峰在280 nm和325 nm附近，深度焙炒样品的最大吸收峰在275 nm和325 nm附近，最大吸收峰的差异可能是由于随着焙炒时间的增加，咖啡样品的化学成分发生变化引起。然而，不同焙炒度样品间光谱图的相似性/差异性很难通过直观的视觉观测来解释，因此需要通过多元数据分析来解析光谱数据，提取有用信息，解释不同类别样品间的异同点。2.3 主成分分析（PCA）PCA是一种无监督模式识别方法，它将原始数据矩阵转换为由主成分（PCs）组成的新矩阵，PC间相互正交，且每一PC为原始数据的线性组合，起到了压缩变量的作用。PCA已被广泛用于咖啡的风味评价、品质分析及质量控制过程中15,16。如图2所

17、示，96个样品的一阶导数光谱数据矩阵的PCA得分投影图，前两个主成分的总方差贡献率为99.1%，其中PC1占97.4%，PC2占1.7%，在PC1方向上，浅度、中度和深度三类样品可大致按从左到右的方向区分开来，其中浅度焙炒样品聚集最为紧密，在PC1上的得分全部为负；中度焙炒样品在PC1方向上得分在“0”附近，部分为正，部分为负，个别样品与深度焙炒样品重叠；深度焙炒样品在PC1方向上得分全部为正，这一类样品聚集较为分散，其中69号、70号、85号、86号样品与中度焙炒组距离较近，剩余样品基本上可以在PC1方向上与浅度、中度样品区分开；在PC2方向上三类样品的得分正、负皆有，除深焙组的五个样品得分

18、负值较小外，剩余样品在PC2方向上基本上相互重叠，这与PC2的方差贡献率（1.7%）较小相一致。总体上讲，除部分样品在组间相互重叠外，大部分样品可基本上分为3类，但样品聚集较为分散。图2 以96个样品的一阶导数光谱数据矩阵（96个样品´ 311个波长）为输入变量的主成分分析投影图Fig. 2 Score plot on the first two principal components based on the 1st derivative data matrix of 96 coffee samples2.4 系统聚类分析（HCA）HCA是一种无监督模式识别方法，与PCA相类似，

19、均不需要事先知道数据的分类信息。HCA应用于图 3 96个咖啡样品紫外可见光谱数据矩阵的系统聚类分析的系统树图Fig. 3 The dendrogram from cluster analysis of 96 coffee samples based on the 1st derivative UV-Vis spectroscopic data一阶导数光谱数据矩阵（96个样品 ´ 311个波长）以评价样品间的相互关系和分类情况，图3为系统聚类分析的系统树图，从图中可以看出，不同焙炒度的样品依据它们之间欧氏距离的不同最终分为3类，浅度（A）、中度（B）和深度（C），其中深度焙炒的四个样

20、品：69号、70号、85号、86号被错分到中度焙炒组里，与样品在PCA的二维得分投影图结果相一致，支持PCA的分析结果。2.5 线性判别分析（LDA）LDA是一种常用的数据分类方法，该方法通过优化数据向量以实现类别间的最大分离，新的判别函数为原始变量的线性组合，最大化类别间样品间方差比及最小化类别内样品间方差比，判别函数的数量为样品类别数减1，通常由基于前两个或三个判别函数的二维或三维投影图来实现分类研究。本研究中校正模型的每个样品被定义为一个模糊变量（浅度= 1，中度= 2，深度= 3），截断值= 0.5作为模糊变量预报值的图 4 96个咖啡样品在LDA模型中由前两个判别函数定义的得分投影图

21、Fig. 4 Distribution of 96 samples of Coffee for light, medium and dark roasting degree on the plane defined by the first two functions of the LDA model分类准则。96个样品在由前两个判别函数定义的二维得分投影图如图4所示，从图中可以看出，与PCA得分投影图相比，三类样品的聚集更为紧密，每类样品投影的相对位置发生改变，在DF1方向上，深度焙炒样品得分全部为负，中度焙炒样品得分大多数为正，部分为负，浅度焙炒样品得分全部为正，基本上可实现类别间分离；在

22、DF2方向上，深度和浅度焙炒样品得分大部分为正且相互重叠，而中度焙炒样品得分全部为负，可与上述两类样品较好的分离，因此，DF1-DF2二维投影图能够取得令人满意的分类效果。2.6 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图 5 96个咖啡样品的模糊变量在PLS-DA模型中的预报值投影图Fig. 5 Prediction set test of PLS-DA model based on the 1st derivative spectroscopic data matrix of 96 samples无监督模式识别方法PCA和HCA只能定性的给出样品的分类信息，而不能从定量的角度进行解释， 因此下一

23、步采用有监督模式识别方法PLS-DA、BP-ANN和LS-SVM分别建立校正模型对咖啡样品的焙炒度进行预测。与LDA模型相类似，在PLS-DA、BP-ANN和LS-SVM模型中每个样品被定义一个模糊变量（浅度= 1，中度= 2，深度= 3，截断值为0.5），以校正集和预报集的识别率和预报率作为模型好坏的判别指标。PLS-DA模型通过留一法交叉验证（LOOCV）17优化模型确定最大因子数为4，图5为96个样品在PLS-DA中模糊变量预报值的投影图，横坐标表示样品编号，纵坐标为模糊变量的预报值，图中红色圆圈、深蓝色正方形、绿色菱形分别表示浅度、中度、深度样品的校正集，浅蓝色圆圈、浅蓝色正方形、浅蓝

24、色菱形分别表示浅度、中度、深度样品的预报集，三条水平的品红色虚线表示每类样品的截断值，预报值在0.5-1.5范围内属于浅度样品，在1.5-2.5范围内属于中度样品，在2.5-3.5范围内属于深度样品，从图中可看出，除深度焙炒样品的校正集和预报集各有两个样品被错误分类外（预报值均小于2.5），其余样品的预报值均落在各自定义的范围外，PLS-DA模型的识别率和预报率分别为96.7%和94.4%。2.7 不同模式识别方法PLS-DA、BP-ANN、LS-SVM对咖啡焙炒度的预测结果比较在应用紫外可见光谱数据建立模型时通常存在非线性的问题，通常是由于样品在高浓度时不符合比尔定律，检测器响应的非线性及光

25、源漂移等因素的影响，因此有必要采用非线性的多元校正模型进行预报，本文采用BP-ANN、LS-SVM来处理光谱数据非线性的问题，并与PLS-DA模型的预报结果比较以优选最适模型，表2为PLS-DA、BP-ANN和LS-SVM模型的预报结果。BP-ANN是一个包括输入层、隐含层和输出层的反传人工神经网络结构，详细信息可参考文献18,该模型必须通过优化参数来得到最好的结果，参数包括隐含层神经元数、学习速率、最大训练次数、动量矩等。通过LOOCV优化得到BP-ANN模型的隐含层神经元数、学习速率、最大训练次数分别为8、0.1、800次，此时模型的识别率和预报率分别为100%和97.2%。LS-SVM是

26、基于经典支持向量机的一种修正算法19，是另一种非线性回归方法，在此方法中仅表 2 PLS-DA、BP-ANN和LS-SVM模型的预报结果Table 2 The prediction performance of PLS-DA、BP-SNN and LS-SVM models化学计量学方法识别率（%）预报率（%）PLS-DAa96.7% (2)b94.4% (2)BP-ANNc100% (0)97.2% (1)LS-SVMd100% (0)100% (0)a: PLS-DA模型的因子数为4；b: 数字（.）表示错误分类的样品数；c: BP-ANN模型参数：隐含层神经元数=8，学习速率= 0.1，

27、最大训练次数为800次，d: LS-SVM模型中（g，s2）参数优化值（g=40.5，s2=3.2）线性方程作为模型的支持向量，径向基函数常作为模型的高斯核函数，该模型中两个重要的参数需要优化，调节参数gam (g)和径向基核函数参数sig2 (s2)，通过二步网格搜索技术和LOOCV来实现。LS-SVM模型的参数g = 40.5，s2 = 3.2，识别率和预报率均为100%，优于PLS-DA和BP-ANN模型，可能是由于LS-SVM能够较好的处理光谱数据存在的非线性问题，因此LS-SVM被选为最优的模式识别方法来预测咖啡的焙炒度，3 结论与讨论本文建立了一种快速的紫外可见光谱指纹图谱分析方法

28、，能够较好的区分不同焙炒度的咖啡样品，且通过非线性的模式识别方法能够实现焙炒度的定量预测，取得令人满意的结果。咖啡试样的紫外可见光谱数据较复杂且信号相互重叠，因此采用合适的化学计量学方法解析复杂的光谱数据矩阵来提取有用信息，包括线性和非线性的多元校正方法，不同模型的预报结果表明LS-SVM是最适合本研究的模式识别方法。紫外可见吸收光谱法样品前处理少，耗费低，无需有机溶剂，表明此方法在咖啡焙炒度质量控制上是可行的，并且可建立相似的方法用于其它饮料作物的质量控制。参考文献1Illy A, Viani R. Espresso Coffee: The science of qualityM. Lond

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