生化导师0843核酸

1、核酸的变性、复性与杂交核酸的变性、复性与杂交 核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的间的氢键断裂氢键断裂，变成单链结构的过程。，变成单链结构的过程。 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它，所以它的一级结构的一级结构( (碱基顺序碱基顺序) )保持不变。保持不变。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。的变性

2、。A A 核酸的变性核酸的变性（denaturationdenaturation） RNARNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有行为所引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。性的情况。例如例如: :天然状态的天然状态的DNADNA在完全变性后，在完全变性后， 紫外吸收紫外吸收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%.40%. 而而RNARNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%1.1%。这种现象称。这种现象称为为增色效应增色效应.

3、.（1 1）热变性）热变性 结构：螺旋结构：螺旋线团线团 理化性质：紫外吸收理化性质：紫外吸收 粘度粘度比旋光度比旋光度 生物活性：生物活性生物活性：生物活性 或丧失或丧失 超螺旋超螺旋DNADNA的性质的性质 结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。变变性性 DNA的变性温度的变性温度：加热：加热DNA溶液，使其对溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是大值一半时的温度，就是DNA的的变性温度变性温度（熔点，熔点，熔解温度，熔解温度，解链温度解链温度: : TmTm）。）。（2

4、2）熔点）熔点（TmTm）DNADNA变性的特征变性的特征 DNADNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起区间内完成。因此，通常将引起DNADNA变性的温变性的温度称为度称为熔点熔点，用，用T Tm m表示。表示。 一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间。之间。DNADNA的的T Tm m值与分值与分子中的子中的G G和和C C的含量有关。的含量有关。 G G和和C C的含量高，的含量高，T Tm m值高值高。因而测定。因而测定TmTm值，可反值，可反映映DNADNA分子中分子中G, CG,

5、 C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算： （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm的高低与的高低与DNA分子中分子中G+C的含量有关，的含量有关，G+C的含量越高，则的含量越高，则Tm越高越高。经验式经验式: : (G-C)%=(Tm-69.3)(G-C)%=(Tm-69.3)2.442.442 2复性（复性（renaturationrenaturation） （1 1）复性）复性 理化性质理化性质: 比旋光度比旋光度 粘度粘度)p( 高于Tm值5 复性也复性也称退火称退火 缓缓慢慢冷冷却却迅迅速速冷冷却却生物活性得到部分恢复生物

6、活性得到部分恢复 B DNA复性复性（2 2）影响复性的因素）影响复性的因素 样品的性质样品的性质 DNADNA的浓度的浓度 DNADNA片段的大小片段的大小 温度温度 离子强度离子强度 在适当的条件下，两条彼此分开的单链在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为程称为复性复性。DNADNA复性后，一系列性质将得到恢复，复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到但是生物活性一般只能得到部分的恢复部分的恢复。DNADNA复性的程度、速率与复性过程的条复性的程度、速率与复性过程的条件有关。件有关。 将热变性的将热变性的D

7、NADNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNADNA不可不可能复性。但是将变性的能复性。但是将变性的DNADNA缓慢冷却时，缓慢冷却时，可以复性。可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，越容易。此外，DNADNA的复性也与它本身的复性也与它本身的组成和结构有关。的组成和结构有关。（3 3）复性动力学）复性动力学 DNADNA的复性过程是一种双分子反应的复性过程是一种双分子反应 DSSk S S：single strand DNAsingle strand DNA D D：double strand DNAdouble strand DNA 2kcd

8、tdc 经重排，积分等经重排，积分等 式中式中 C C0 0：t=0t=0时，起始时，起始DNADNA的浓度（的浓度（mol/Lmol/L） C C：t t时间时，单链时间时，单链DNADNA的浓度（的浓度（mol/Lmol/L） k k：复性反应常数（：复性反应常数（L/molL/molsecsec） t t：复性时间（：复性时间（secsec） C CC C0 0= 1 1 1+kC1+kC0 0t t21CC0 Cot : 21时的时的CotCot值，即指复性完成一半时的值，即指复性完成一半时的CotCot值值。 核酸杂交可以是核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RN

9、A杂交。杂交。 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段的核酸片段称为同源顺序称为同源顺序。 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的物种中具有同源顺序的DNA或或RNA片段。片段。 常用的常用的核酸分子杂交技术有：核酸分子杂交技术有：原位杂交、原位杂交、斑点杂交、斑点杂交、Southern杂交及杂交及Northern杂交杂交等。等。 在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定

10、标记的已知顺序的核酸片段称这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为为探针探针核酸的杂交：核酸的杂交：3 3杂交（杂交（hybridizationhybridization） 核酸的杂交：核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之是指不同来源的单链核酸之间可通过碱基互补形成双螺旋结构。间可通过碱基互补形成双螺旋结构。 单链单链DNADNA与单链与单链DNADNA杂交（杂交（DNA-DNADNA-DNA）单链单链DNADNA与单链与单链RNARNA杂交（杂交（DNA-RNADNA-RNA）单链单链RNARNA与单链与单链RNARNA杂交（杂交（RNA-RNARNA-RNA）利用核酸杂交可检测特定的核苷酸

11、片段或研究利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。同源性等。加热加热双链双链DNADNA单链单链DNA杂交杂交杂化双链杂化双链在在DNADNA复性过程中复性过程中, ,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间的核酸分子之间, ,也可以发生在碱基序列部分互补的不同的也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNADNA之之间或间或DNADNA与与RNARNA之间之间 , ,这种现象称为这种现象称为分子杂交分子杂交。分子杂交分子杂交 核酸的杂交核酸的杂交用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交 19751975年英国

12、年英国E. M. SouthernE. M. Southern首创的首创的Southern Southern blottingblotting（SouthernSouthern印迹）印迹）方法方法原理原理探针：作为检测用的已知探针：作为检测用的已知DNADNA序列或序列或RNARNA序列的片段序列的片段 （一）一般性质：（一）一般性质：分子大小：分子大小：DNA DNA MrMr 10 106 610101010或更大或更大RNA RNA MrMr104104 106106或更或更性状：性状：DNADNA为白色纤维状固体，而为白色纤维状固体，而RNARNA为白色粉末。为白色粉末。溶解度：溶解度

13、：DNADNA和和RNARNA均不溶于一般的有机溶剂，微均不溶于一般的有机溶剂，微 溶溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。 七、核酸的性质和最常用的研究方法七、核酸的性质和最常用的研究方法（二）粘度（二）粘度（三）酸碱性质（三）酸碱性质 （四）紫外吸收（四）紫外吸收 核酸的分离核酸的分离. . 提纯和定量测定提纯和定量测定核酸的超离心核酸的超离心用用1 12 2个已知浮力密度的标准个已知浮力密度的标准DNADNA样品作参考样品作参考 102022010)rr (2 . 4 式中式中 ：未知：未知DNADNA的密度的密度00：标准：标准DNADNA的密度的密

14、度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/ /秒）秒） r r： 未知未知DNADNA与转轴之间的距离与转轴之间的距离 r0r0：已知：已知DNADNA与转轴之间的距离与转轴之间的距离 1 1核酸浮力密度的测定核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度氯化绝（氯化绝（CsClCsCl）密度梯度沉降平衡）密度梯度沉降平衡 （五）沉降特性（五）沉降特性2 2DNADNA中中G-CG-C含量的测定含量的测定 G-CG-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系对的含量与浮力密度之间呈正比关系 Rolfe-MeselsonRolfe-Meselson导出了如下

15、公式：导出了如下公式： =0.100=0.100（G-C%G-C%）+1.658(g/cm+1.658(g/cm3 3) ) 知道了浮力密度就可计算出知道了浮力密度就可计算出G-CG-C对的含量对的含量 3 3核酸的构象和分离核酸的构象和分离 ：RNARNA环状环状DNADNA线状线状DNADNA蛋白质蛋白质 DNA DNA 沉降沉降（七）（七）核酸的核酸的凝胶电泳凝胶电泳 核酸研究中最常用的方法核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。优点：简单、快速、灵敏、成本低。 通过凝胶电泳通过凝胶电泳 （1 1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2

16、2）测定分子大小。）测定分子大小。 （3 3）估计核酸的构象。）估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1 1琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agarose gel agarose gel electrophoresiselectrophoresis） 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2 2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electr

17、ophoresis） 用于分析用于分析RNARNA或或MrMr小于小于1000bp1000bp的的DNADNA片段片段 适用于大分子核酸，一般用于适用于大分子核酸，一般用于DNADNA分析。分析。 DNADNA聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase chain (Polymerase chain Reaction,Reaction,PCRPCR) ) 是是体外扩增体外扩增DNADNA应用应用最广泛的一种生物最广泛的一种生物技术技术DNADNA的酶法测序的酶法测序: :核酸的核苷酸序列测定核酸的核苷酸序列测定DNADNA的化学修饰法测序的化学修

18、饰法测序（1 1）酶法（双脱氧法、末端终止法）酶法（双脱氧法、末端终止法） 物物DNADNA固相合成固相合成( (亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法) )DNADNA的化学合成的化学合成6.3 6.3 核酸的性质核酸的性质 含氮碱基具有芳香环的结构特点。由于环含氮碱基具有芳香环的结构特点。由于环上极性基团（如羰基、氨基等）的存在，上极性基团（如羰基、氨基等）的存在，碱基能够发生酮式碱基能够发生酮式烯醇式或氨式烯醇式或氨式亚亚氨式的互变异构。因此，碱基既有芳香氨式的互变异构。因此，碱基既有芳香环的特性，也具有氨、酮和烯醇等相应环的特性，也具有氨、酮和烯醇等相应的化学性质。的化学性质。6.3.1 6.3.1 含氮碱基的性质含氮碱基的性质（4 4）碱基的性质）碱基的性质 一般的物理性质一般的物理性质 互变异构现象互变异构现象 CNNOOHHCNNOHHOuracil 酮式