新一代高通量技术在龋病相关的口腔菌群宏基因组学研究中的应用

1、中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期Chin J Stomatol Res （Electronic Edition ）, August 2011, Vol5, No4341述评··新一代高通量技术在龋病相关的口腔菌群宏基因组学研究中的应用凌均棨杨芳滕飞龋病是人类最普遍的感染性疾病，针对龋病的病因学研究、风险评估乃至预防策略是目前研究的重点问题。本研究小组采用新一代高通量技术包括454FLX Titanium 测序、Solexa GA 测序及Geochip 3. 0功能基因芯片，就唾液菌群中的细菌谱系和功能基因组成进行深入解析，阐释成人唾液微生物群落的生态

2、特性，通过对龋活跃人群和健康人群的比较分析，发现两者在基因和群落结构上具有鉴别特征，从而探讨唾液菌群对于龋病易感活跃度的检测和早期防控的意义，为研究龋病的发生发展机制并展开相应的疾病预防和治疗策略提供新的思路。一、人类共生菌群基因组计划和龋病病因学说龋病四联因素学说认为细菌、环境、宿主、时间均是龋病发生的必要条件，细菌是其中一项重要环节1-2。关于龋病的病因学说存在经典的“特异性菌斑假说”和“非特异性菌斑假说”。“非特异性菌斑菌斑假说”认为，龋病源于菌斑群落所有成员共同作用的结果3-4；“特异性菌斑假说”则认为仅有少数细菌在龋病发病中起作用4-5，主张针对少数特定的“致龋菌”进行有效控制来监控

3、龋病。变形链球菌（Streptococcus ）因具有产酸性及胞外合成葡聚糖的功能，被认定为“致龋菌”5。国内外对变形链球菌结构和功能的研究愈益深入时，Kleinberg 6发现致龋特性并非完全依赖于变形链球菌的存在，同时还有大量其它口腔细菌被认为与龋病的发生密切相关7。因此，上述两种假说均存在争议。2000年以来，越来越多研究者趋向于认同新兴“生态菌斑假说”1，8-9，即将菌斑作为一个整体来看待其所表现出的生物学行为。“生态菌斑假说”认为，具备所谓“致龋性”的细菌绝非仅限于变形链球菌，而是种类丰富的一群细菌，这些细菌原本就存在于口腔正常菌群，众多微生物保持彼此密切接触，通过复杂的相互作用使整

4、体维持脱矿与再矿化持平；当微环境发生改变，生物膜内菌群或者基因成分发生偏倚向脱矿一方倾斜，不断的恶性循环使脱矿持续进行进而导致龋坏。该学说从整个口腔群落生态角度阐释了龋病发生与发展的微观原理，为研究龋病病因提供了新的切入点。口腔菌群作为人体共生菌群非常重要的栖息位点，其群落结构复杂多样。2007年，美国国立卫生研究院（NIH ）正式启动人类共生菌群基因组计划（Human Microbiome Project ，HMP ），认为寄生于人体的大量共生菌群可作为人体的第二基因组，是后天禀赋的主要承载者，与人体的健康息息相关；只有在全面认识人体共生菌群的基础上，才能深度揭示其对人体健康或疾病状态的影响

5、，从而构建微生物群落存在及变化情况与特定的疾病之间的联系10。由于技作者单位：510055广州，中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所通信作者：凌均棨，电子邮箱：lingjqmail. sysu . edu . cn342中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期Chin J Stomatol Res （Electronic Edition ）, August 2011, Vol5, No4术条件限制，对于口腔菌群群落成员构成缺乏全面的了解，进而在不够深入的认识层面上所进行的龋病病因学研究存在一定的局限性。二、非依赖培养口腔菌群研究技术的发展自1

6、924年J . K . Clarke 首次分离出变形链球菌以来，对口腔微生物的认识主要依赖于传统的分离培养方法，基于该水平的研究大约鉴定了250余种口腔细菌11-12，但该方法对难于培养或生长速度较为缓慢的细菌则表现为假阴性结果。据报道环境中可培养的细菌所占比例不超过113-14，故通过培养方法来认识口腔细菌并致力于圈定致龋菌的研究具有较大的局限性。随着分子生物学技术的飞速发展，不依赖于培养的分子检测手段陆续涌现，包括16S rRNA 克隆测序、DNA 杂交芯片、变性梯度凝胶电泳（DGGE ）、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP ）等技术手段，主要依赖于小核糖体RNA （small sub

7、unit 16S ribosomal RNA ）在微生物群体中的广泛存在及其可作为种系发育的生物进化标志15。2005年，Aas 等学者11采用16S rRNA 克隆测序的方法第一次获得较为全面的健康人口腔菌群分布图谱，从5个健康人口腔内9个位点取样，提取基因组DNA 进行16S rRNA 扩增并转化入感受态大肠杆菌，然后随机挑取单克隆测序进行菌种鉴定。该研究结果表明，健康人群的口腔菌群约含有141个优势菌种，其中60难于培养，多数位点含有2030种的优势菌种，就每个个体而言口腔内优势菌种约3472种。Asa 等16亦采用该手段分析儿童和青少年恒牙龋病相关的菌群图谱，从不同程度龋损处及健康釉质

8、表面收集菌斑，共发现197个细菌菌种，同时应用于集成了110个常见口腔细菌信息的芯片进行分析，发现如下规律：含有变形链球菌的个体，其他菌属诸如奇异菌属（Atopobium ）、丙酸菌属（Propionibacterium ）以及乳酸菌属（Lactobacillus ）常常以更高比例存在；在没有检测到变形链球菌属的个体，乳酸菌属、双歧杆菌属（Bifidobacterium ）以及低pH 值的非变形链球菌属则是优势菌属。该研究提示，龋病发展的不同阶段以及恒牙乳牙之间的细菌图谱分布均存在显著差异，除变形链球菌之外，韦荣菌属（Veillonella ）、乳酸菌属、双歧杆菌属、丙酸菌属、低pH 的非变形

9、链球菌属、放线菌属（Actinomyces spp ）以及奇异菌属都与龋病的进展存在显著相关16。Becker 等17研究严重儿童早期龋病相关的菌斑菌落，采用排布23个细菌信息的芯片进行DNA 杂交检测，结果提示血链球菌（Streptococcus sanguinis ）与健康相关联，而戈氏放线菌（Actinomyces gerencseriae ）、双歧杆菌、变形链球菌、韦荣菌则被认为与龋病相关联。Kanasi 等18采用含有74个细菌DNA 探针的芯片研究儿童龋病，认为加氏乳酸菌（Lactobacillus gasseri ）、发酵乳酸菌（Lactobacillus fermentum ）

10、、阴道乳酸菌（Lactobacillus vagi-nalis ）、变形链球菌以及远缘链球菌（Streptococcus sobrinus ）均表现出与龋病正相关，而在基于错误发现率（faulse-discovery rate ）的多重比较后，黑色普氏菌（Prevotella nigrescens ）仍保持与龋病相关。Li 等19通过DGGE 手段评估成人龋活跃人群和健康人群唾液样品，发现无龋人群有更高的菌种多样性，提示一部分口腔细菌在龋活跃人群中可能缺失、抑制或者被替换。分子生物学技术手段的广泛应用为认识口腔细菌及其在口腔系统性疾病的关系研究中提供了快捷高效的技术手段，使人类对口腔菌群的了解

11、深入到新的层面，在此基础上通过非培养手段进一步认识了450余种口腔细菌，至此人类口腔系统被认为含有500700种细菌11，20-22。但如上所述，各个研究结果彼此之间差异较大，缺乏可比性，研究手段和取样方法等均对结果产生一定的影响，且该水平的分子生物学检测固有的弊端亦慢慢呈现。对于16S rRNA 克隆测序技术，每个样品随机挑取的单克隆数量是限定细菌多样性挖掘深度的决中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期Chin J Stomatol Res （Electronic Edition ）, August 2011, Vol5, No4343定因素，即使每份样品挑取上千个克隆，其

12、检测到的也仅是极少数高丰度细菌种类，对低丰度菌种的认识需要在克隆数量上成百倍增长，此时耗费的时间、人力和经济因素已成为制约瓶颈；DGGE 技术依于16S rRNA 片段的GC 含量构成差异所表现出各异的迁移图谱23，但对于浩瀚的菌群来说，其准确性、分辨率以及敏感度都不尽如人意；传统的DNA 芯片技术则只能针对为数不多的，且人为界定的少数已知细菌菌种进行检测，而对绝大多数的“未知”都无从探讨。至此，深入分析口腔群落的技术手段亟待改革更新，以弥补当前研究对口腔微生物群落深度和广度挖掘的制约。2005年始诞生的454和Solexa 新一代测序技术标志着快速基因组测序时代的到来，为这一瓶颈问题带来新的

13、契机。2008年8月Keijser 等24利用454GS-20测序系统对多个健康人唾液及牙菌斑合并样品进行检测，分析测序所得的19万个细菌16S rRNA 序列，在唾液和牙菌斑中分别鉴定出185和267个细菌属，分别涵盖了5600和10000个菌种。Zaura 等25对3个健康人口腔菌群进行研究，于每个个体发现超过500种细菌。上述研究结果使人类对健康口腔菌群细菌种类的了解呈数量级提升，认识达到前所未有的深度。应用新一代测序技术，Ling 等26研究儿童早期严重龋病，认为在牙菌斑样本中链球菌属、韦荣菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属以及硫单胞菌属均表现与龋病相关，而唾液中未发现龋病相关细菌。

14、新一代技术的革新为研究口腔菌群及与口腔疾病相关的微生物病因学因素探讨提供了新的视角，展示出口腔菌群较为全面的菌种多样性分布特征。但目前采用高通量手段研究口腔菌群的相关报道多集中于健康人口腔菌群，且主要关注于细菌种的分布，未能涵盖基因层面上的深入分析以及将其与疾病状态紧密结合起来的有效生物标记探讨。鉴于细菌之间复杂相互作用所表现出的基因交换与转移等作用，本课题拟采用新一代高通量生物技术，取其各自优势互补全面进行涵盖菌种和功能基因水平的筛选与评价，以期衡量健康和疾病患者口腔菌群群落生态差异。三、新一代高通量技术的应用及挑战1. 高通量功能基因芯片：基因芯片技术发展相对成熟，具备高度的并行性、多样性

15、、微型性和自动化特点，如前述应用于菌群研究的传统DNA 芯片，其上罗列了数十或百计的不同菌种16S rRNA 信息，从而可以高效进行物种多样性分析；而新一代芯片技术Gepchip 3. 027采用高通量信息配置平台，在菌种信息检测的基础上，融入基因信息的筛查，借此将菌种、基因以及功能三者相联系，是一种强大的、高通量的宏基因组学分析工具，使芯片技术变革为高效、快速、大规模获取相关生物信息的重要手段。Geochip 3. 0基因芯片其内含有约28000个探针，覆盖292个功能基因家族的57000个基因，包含了涉及微生物所参与的各种过程主要编码酶的基因序列探针，涉及碳循环、氮循环、磷循环、硫循环、各

16、种金属抗性、抗生素抗性、有机污染物降解和能量传递等相关代谢过程，并且有基于gyrB 的系统发育分析标记，阳性对照来自于核糖体基因，阴性对照来自于人类、植物和超嗜热菌基因，该芯片的敏感性和特异性已得到反复检验肯定。采用Geochip 3. 0评价微生物群落结构、功能和动态具备以下特点：（1）简单、快速并且价格较测序方法相对低；（2）特异性和敏感性高，对目标微生物有广谱性；（3）能够在较宽动态范围内精确的定量；（4）具备高通量特性且能够平行分析；（5）对来自不同地点、不同实验、不同实验室和不同时间的样品具有可比性。目前该Geochip 3. 0功能基因芯片已成功运用于土壤和海洋等复杂环境微生物群落

17、功能344中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期Chin J Stomatol Res （Electronic Edition ）, August 2011, Vol5, No4基因结构的监控，藉此将微生物多样性和微生物功能联系起来28-29。但尚未有将该技术手段应用于人体共生菌群研究的相关报道。本研究拟借助含有已知生物功能的探针将与龋病相关的口腔菌群生态特征与功能相结合，力求寻找口腔菌群中的基因构成特点，并探索相应的生物标记与不同疾病状态相关联。2. 二代测序技术：高通量芯片技术的应用优势在于方便、快捷、目的性明确且费用较低，但其局限性在于所有的检测均是针对“已知”，无论是

18、细菌成分还是基因成分；由于目前人类对自然界认知的局限性，不可避免尚有无数的“未知”信息被芯片忽略。新一代测序技术的运用在一定程度上可以弥补该局限性，两者的结合运用优势互补将更为全面的展示菌群特征。新一代测序技术对生物学发展起重要作用，它从根本上改变了生命蓝图的研究模式，推动了个体化疾病诊疗和预防的可能。Roche 454，Illumina Solexa 已发展为主流的高通量测序技术，一次实验所产生数10亿碱基的数据通量，使研究能够在较短时间内获得海量信息，为深入了解人体共生菌群提供了强有力的工具。454公司推出革命性的基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统454GS FLX Titanium

19、，依靠生物发光进行DNA 序列分析，在DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与荧光信号释放相偶联。通过检测相应的荧光信号及强度，实现实时测定DNA 序列碱基构成。其技术特点如下：（1）单轮测序反应耗时10h ；（2）单次获得46亿个碱基对；（3）序列读长可达约450个碱基；（4）单轮反应可得到超过100万个序列；（5）测序结果一致性超过99. 9930-31。Illumina Genome Analyzer 是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，其将DNA 随机片段附着于特定载体，经延伸和桥式扩增形成数以亿计的单分子簇。利用带有荧光标记

20、的dNTP ，通过可逆终止的化学反应原理进行测序。其技术特点包括：（1）测序通量非常高，单次反应达到3G 以上数据通量；（2）DNA 序列读长相对短，当前最长片段达200000；（3）准确率超过98. 531-32。测序技术为大规模样品的群落解析提供了可能，使其被广泛应用于微生物群落分析研究。通过构建宏基因组文库并测序分析，从而全面解析微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系，不仅得到物种水平的相关信息，还能够在基因及其代表的功能水平进行解析与比较，提供对群落功能潜力的全面观察。其优点主要体现为：（1）物种检测深度，基于传统方法所能观察到的生物多样性远远小于实

21、际水平，而测序技术可以涵盖的范围以数量级扩大，因此测序技术在全面调查环境微生物多样性方面具有不可替代的优势；（2）研究定量化，测序结果中单条序列的测序次数可反映该物种在环境中的数量及丰度，因此可以同时获得定量与定性信息；（3）高通量特征，单次测序反应信息量大，且可通过多样品平行标记技术区分样品来源，实现同时对多个样品进行检测分析。新一代测序技术在为认识群落结构、研究群落差异和功能提供良好契机的同时，其产生的大量TB 数目级的数据给后期的生物信息分析带来了巨大的压力，数据的存储、处理、分析、展示亦面临巨大挑战。面对海量的短片段序列，常规的分析方法已经无法适用，如何定义哪些片段是有效的，如何快速地

22、提取这些有效片段，如何对其进行科学合理分析并挖掘其中的生物学意义，如何以简单、标准化的流程对数据进行交叉比较等，均需要进一步高效针对大量短片段的生物信息学分析方法的开发和流程构建。本研究小组采用高通量生物技术，包括454GS FLX Titanium 、Solexa GA 以及Geochip 3. 0基因芯片研究唾液微生物群落，全面阐释了成人唾液微生物群落的生态特征包括菌种构成中华口腔医学研究杂志（电子版）2011年8月第5卷第4期Chin J Stomatol Res （Electronic Edition ）, August 2011, Vol5, No4345特性及基因构成信息，并对龋活

23、跃人群及健康人群进行相互比较分析，探讨可能的参与龋病发生发展的微生物因素。从细菌分布图谱发现唾液微生物群落具备丰富的菌种多样性特征，人与人之间缺乏保守的核心菌群存在，但在基因层面上的较为保守，主要功能群分布非常一致，从而维持内在生理功能代谢网络稳定；龋活跃患者来源的唾液菌群群落结构较健康人来源者变异更大，且两者在基因和群落结构上具有一定鉴别特征；特异物种例如Prevotella 细菌属在两人群中分布的相对丰度存在显著差异，同时在复杂碳水化合物代谢、氮代谢、氨基酸转运代谢等相关功能群的功能基因亦呈现出显著性差异，从而提供系列可能参与或代表了龋病发生发展的生物相关因子，经进一步的验证或可作为前期预

24、防和逆转的生物标记，使龋病的诊断和治疗向预警和防治模式转变。进一步的大规模人群唾液菌群分析及相关动物实验验证，可望建立经由唾液样品快速筛查龋病高危人群的手段，从而提供更为有效的治疗和预防措施33。参1234567891011121314151617181920212223考文献Marsh PD . Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease . Adv Dent Res ，1994，8（2）：263-271. Roesch LF ，Fulthorpe RR ，Riva A ，et a

25、l . Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity . ISME J ，2007，1（4）：283-290. Theilade E . The non-specific theory in microbial etiology of inflammatory periodontal diseases . J Clin Periodontol ，1986，13（10）：905-911. Marsh PD . Dental plaque as a biofilm and a microbial community

26、-implications for health and disease . BMC Oral Health ，2006，6Suppl 1：S14. Loesche WJ . Role of Streptococcus mutans in human dental decay . Microbiol Rev ，1986，50（4）：353-380. Kleinberg I . A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation

27、 ：an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis . Crit Rev Oral Biol Med ，2002，13（2）：108-125. Beighton D . The complex oral microflora of high-risk individuals and groups and its role in the caries process . Community Dent Oral Epidemiol ，2005，33（4）：248-255. Marsh PD . De

28、ntal diseases-are these examples of ecological catastrophes ? Int J Dent Hyg ，2006，4Suppl 1：3-10；discussion 50-52. Marsh PD . Are dental diseases examples of ecological catastrophes ? Microbiology ，2003，149（Pt 2）：279-294. Peterson J ，Garges S ，Giovanni M ，et al . The NIH Human Microbiome Project . G

29、enome Res ，2009，19（12）：2317-2323. Aas JA ，Paster BJ ，Stokes LN ，et al . Defining the normal bacterial flora of the oral cavity . J Clin Microbiol ，2005，43（11）：5721-5732. Kroes I ，Lepp PW ，Relman DA . Bacterial diversity within the human subgingival crevice . Proc Natl Acad Sci U S A ，1999，96（25）：145

30、47-14552. Whitman WB ，Coleman DC ，Wiebe WJ . Prokaryotes ：the unseen majority . Proc Natl Acad Sci U S A ，1998，95（12）：6578-6583. RappéMS ，Giovannoni SJ . The uncultured microbial majority . Annu Rev Microbiol ，2003，57：369-394. Woese CR ，Fox GE . Phylogenetic structure of the prokaryotic domain

31、：the primary kingdoms . Proc Natl Acad Sci U S A ，1977，74（11）：5088-5090. Aas JA ，Griffen AL ，Dardis SR ，et al . Bacteria of dental caries in primary and permanent teeth in children and young adults . J Clin Microbiol ，2008，46（4）：1407-1417. Becker MR ，Paster BJ ，Leys EJ ，et al . Molecular analysis of

32、 bacterial species associated with childhood caries . J Clin Microbiol ，2002，40（3）：1001-1009. Kanasi E ，Johansson I ，Lu SC ，et al . Microbial risk markers for childhood caries in pediatriciansoffices . J Dent Res ，2010，89（4）：378-383. Li Y ，Ku CY ，Xu J ，et al . Survey of oral microbial diversity usin

33、g PCR-based denaturing gradient gel electrophoresis . J Dent Res ，2005，84（6）：559-564. Schloss PD ，Handelsman J . Status of the microbial census . Microbiol Mol Biol Rev ，2004，68（4）：686-691. Kazor CE ，Mitchell PM ，Lee AM ，et al . Diversity of bacterial populations on the tongue dorsa of patients with

34、 halitosis and healthy patients . J Clin Microbiol ，2003，41（2）：558-563. Paster BJ ，Boches SK ，Galvin JL ，et al . Bacterial diversity in human subgingival plaque . J Bacteriol ，2001，183（12）：3770-3783. Bonin PC ，Michotey VD ，Mouzdahir A ，et al Anaerobic biodegradation of squalene ：Using DGGE to monito

35、r the isolation of denitrifyingBacteria taken from enrichment cultures . FEMS Microbiol Ecol ，2002，42（1）：37-49.346 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 中华口腔 医学研 究杂志（电 子版） 2011 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin J Stomatol Res （ Electronic Edition ） , August 2011, Vol5, No4 Keijser BJ ， Zaura E ， Huse SM ， et al. Pyroseq

36、uencing analysis of the oral microflora of healthy adults. J Dent Res ， 2008 ，87 （ 11 ）：10161020. Zaura E ， Keijser BJ ， Huse SM ， et al. Defining the healthy "core microbiome of oral microbial communities. BMC Microbiol ， 2009 ，9 ：259. Ling Z ， Kong J ， Jia P ， et al. Analysis of oral microbiota in children with dental caries by PCR-DGGE and barcoded pyrosequencing . Microb Ecol ， 2010 ，60 （ 3 ）：677-690. He Z ， Deng Y ， Van Nostrand J