铝对大鼠诱导性异位骨形成和矿化的作用及慢性肾功能不全对其作用

1、铝对大鼠诱导性异位骨形成和矿化的作用及慢性肾功能不全对其作用的影响         09-08-11 08:35:00     作者：张义国王松鹤    编辑：studa20【摘要】  目的探讨铝对骨组织的毒性作用及机制。 方法采用不脱钙骨切片技术，配合四环素双标记和骨组织形态计量学，研究不同的铝浓度及不同的肾功能对诱导性异位骨形成及矿化的影响。实验大鼠分为五组：对照组（C）；低剂量铝组（LDA）；高剂量铝组（HDA）；慢性肾

2、功能不全组（CRF）；慢性肾功能不全加高剂量铝组（CRF+HDA）。 结果C组和LDA、CRF组之间无明显不同。HAD组及CRF+HAD组骨组织内四环素荧光双标线短、少，多为单标线，且粗细不一、增宽、融合，表面有较多类骨质沉积，尤以CRF+HAD组为甚。 结论(1)铝可影响大鼠诱导性异位骨形成并阻碍其矿化作用，引起骨软化。(2)慢性肾功能不全可加重铝致骨软化。 【关键词】  铝大鼠诱导性异位骨慢性肾功能不全骨软化    【Abstract】ObjectiveTo explore the toxicity of aluminum to bone tissu

3、e.MethodsNon-decalcification sections with tetracycline double labeling and bone tissue metrology was used to study effects of different concentration aluminum on normal and chronic renal failure(CRF)rats.The experimental rats were randomized into 5 groups:control(C),low dose aluminum(LDA),high dose

4、 aluminum(HDA),CRF,CRF+HDA respectively.ResultsThere were no markedly differences between C,LDA and CRF group.Osteoid deposition on bone tissue surface was found with tetracycline fluorescence double labeling and bone tissue metrology in HDA and CRF+HDA group,especially in CRF+HDA group.ConclusionAl

5、uminum can influence ectopic ossification,obstruct mineral fixation and lead to osteomalacia in rats.Osteomalacia may deteriorate in rats with CRF.    【Key words】aluminum;rats;induced ectopic ossification;chronic renal failure;osteomalacia    1972年Reddi和Huggings1，2用同种脱钙

6、骨基质粉植入动物皮下，建立诱导性骨形成的实验模型。1979年Oohire3等在此基础上用骨基质（bone-matrix gelatin）植入动物皮下，不仅在活体组织内有较强的诱导生骨能力，且在体外培养时，也能诱导培养的肌肉组织生成软骨组织。近年来35人们利用此模型研究了药物对诱导性骨形成的影响。我们采用BMG植入术，并用不脱钙骨切片技术，配合四环素双标记法和骨组织形态计量学，研究了不同剂量铝及不同肾功能对诱导性骨形成和矿化的作用及影响，探讨铝对骨组织的毒性作用和机制。    1材料与方法    11BMG的制备  

7、  1.1.1仪器磁力搅拌器，恒温箱，冰箱。    1.1.2试剂氯仿，甲醇，盐酸，氯化钙，EDTA。    1.1.3骨干骨制备骨基质明胶的骨干骨来自成年SD大鼠的股骨及胫骨骨干。    1.1.4制备方法在相对无菌的条件下取出胫骨和股骨的骨干骨，除去骨干骨的骨髓和附着软组织。骨干骨用蒸馏水冲洗后，在磁力搅拌器的搅拌下作如下顺序处理：（1）室温下氯仿:甲醇（1:1）1h；（2）水洗；（3）2下0.6mol/L盐酸24h（中间换盐酸1次）；（4）水洗（使终末水洗液的pH达中性）；（5）2下2mo

8、l/L氯化钙1h；（6）水洗；（7）2下0.5mol/L EDTA（用NaOH调pH值至7.4）1h；（8）水洗；（9）2下8mol/L盐酸1h；（10）水洗；（11）55灭菌蒸馏水1h；（12）冰冻干燥（或放入液氮内冻干）后转入-20冰箱中保存。    1.2植入术将制备好的圆筒状BMG放入生理盐水内浸湿并复温，用剪刀沿其纵向劈成两半，在半圆的两个长边上剪成交错的槽口，以扩大可接触的面积。将BMG分别植入雄性幼鼠的胸部两侧肌肉内，每侧植入两个长约0.71cm的半圆筒。    1.3动物分组3840天SD系雄性幼鼠100只，作为植入受

9、体，将其分为五组：(1)C组：仅植入BMG不给铝，腹腔内注生理盐水1ml；(2)LDA组：植入BMG并腹腔内注入硫酸铝分子0.2mg/只；(3)HAD组：植入BMG并腹腔内注入硫酸铝分子2mg/只；(4)CRF组：不给铝，仅腹腔注入生理盐水1ml；(5)CRF+HAD组：植入BMG并腹腔注入硫酸铝2mg/只。以上各组均腹腔内注入5次/周。肾功能不全按文献报告的方法，先将左肾2/3切除，1周后行右肾全切除术。实验中LDA组注硫酸铝总量为6mg,HDA组注硫酸铝总量为60mg。    1.4四环素双标记法注射用盐酸四环素按25mg/kg皮下注射，第1次和第2次标记分别

10、在注铝后33天和38天（间隔5天）进行。43天处死动物。    1.5血清铝及骨铝测定取各组大鼠血清及股骨下段剥除软组织待检。湿样品在6070烘干，取0.20.3g样品加入1:5的高氯酸:硝酸4ml消化至近干。转移至10ml比色管用1%HNO3进行稀释后，用日产Z-8000原子吸收分光光度计测定。    1.6取材及组织处理植入后第7、10、15、20天分别取出各组两只大鼠体内植入物，中性甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜观察。各组大鼠在诱导成骨43天后处死，取其BMG诱导物，剥除软组织浸入Villanueva骨染色剂内4天。此后依次用乙醇

11、、丙酮脱水、脱酯，塑料包埋剂包埋。每个包埋剂在Jung ModelK德国产切片机上制备不脱钙骨切片，15m厚用于荧光标记观察，10m厚用于铝染色。    1.7骨组织形态计量各组每张切片随机观察5个视野，所得数据先作方差分析，如有显著性再进行两侧t检验。    1.7.1双标间距（m）用测微尺测量四环素双标线间距离，求均值（本实验此参数可动态反映诱导成骨第3338天的代谢情况）。    1.7.2平均矿化沉积率（m/d）用双标间距除以双标间隔的时间（5天）求出。    1.7

12、.3初铝矿化宽度（m） 用测微尺测量第2次标记线与类骨质间矿化骨宽度，求均值（本实验参数可反映诱导骨第3843天的骨质形成及矿化）。    1.7.4初始矿化沉积率（m/d）由初始矿化宽度除以二标至取材所间隔的时间（5天）求出。    1.7.5类骨质宽度（m）用测微尺测量诱导性新骨尚未矿化部分宽度，求均值。    1.7.6矿化延迟时间（d）以类骨质的平均宽度除以平均矿化沉积率。    1.7.7视野内四环素荧光与方格镜交点数分别记录每个视野内的四环素荧光与方格镜交点数，取

13、均值（交点数多少可反映成骨活动的活跃与否。本实验参数反映了诱导成骨第43天的情况）。     09-08-11 08:35:00     作者：张义国王松鹤    编辑：studa20    2结果    2.1血清铝、骨铝变化各组大鼠血清铝、骨铝的测定见表1。表1各组大鼠血清铝及骨铝含量（每组5只大鼠平均值 从表1可以看出血清铝、骨铝含量呈现与注射剂量一致的显著差异。实验各组大鼠的成骨过程，是在体内不同的血清铝浓度

14、作用下完成的。    22各组大鼠成骨及矿化情况注铝后43天，诱导性骨组织在荧光显微镜下的变化在C组与LDA组、CRF组之间无明显不同。此时沿骨小梁表面可见清晰的四环素双标线，并覆盖有新生的尚未矿化的类骨质。HDA组及CRF+HDA组骨组织内四环素荧光显示的部位较少，少见双标线多为单标线，且标志线粗细不一、有的增宽，融合，表示矿化障碍，在四环素标志线表面可见大量类骨质沉积，尤以CRF+HDA组为甚，表明骨质形成及矿化严重受阻。各组大鼠诱导成骨的骨质形成和矿化情况可用骨计量学动态分析来表示，见表2。表2不同铝剂量对不同肾功能大鼠骨质形成和矿化影响的骨形态计量学动态参

15、数注：三个加铝组与对照组比较，*P0.05；*P0.001；三个加铝组之间比较，P0.001    正常时，骨质形成和矿化过程二者速率应保持一致。从表2可以看出C、LDA、CRF组诱导性骨质成骨量（视野内四环素荧光方格交点数）显著高于HDA、CRF+HDA组。HDA、CRF+HDA组所出现的骨质减少、矿化速率变慢、矿化延迟时间加长以及所形成的骨质中类骨质增宽都很明显，说明已呈现骨软化。    2.3骨铝染色按Maloneg法6进行未脱钙骨铝染色，见钙化骨及类骨质之间有红色条索，且粗细不一，显示骨铝染色阳性。  &#

16、160; 3讨论    诱导性异位成骨经早期的软骨内化骨过程，到2131天左右已形成骨组织。铝对此期的成骨和矿化有何影响，目前未见有关研究。本实验采用四环素双标法对诱导成骨过程进行动态分析表明：C、LDA、CRF组的诱导成骨和矿化作用无明显改变。HDA、CRF+HDA组此时已有明显的骨质形成及矿化障碍，尤以CRF+HDA组表现得更为明显。说明高铝尤其是慢性肾功能不全时给予高铝可严重抑制成骨细胞功能，使成骨及矿化严重受阻，以致给铝后43天四环素荧光与方格镜交点数显著减少，导致骨软化的发生。诱导成骨铝染色显示铝位于类骨质及矿化骨之间，提示铝可以阻碍类骨质矿化。

17、0;   各组大鼠血清铝、骨铝含量与给铝的剂量多少、不同的肾功能情况呈显著差异。其中HDA、CRF+HDA组血清铝及骨铝含量最高，显示高剂量给铝和慢性肾功能不全都是引起铝致骨毒性作用的两个始动因素，且后者起促进及加重作用。建议临床上对肾功能不全的病人要减少或避免铝盐的摄入，以免引起中毒性铝骨病。提议有关铝厂对职业性骨病病人进行血清铝、骨铝测定及不脱钙骨切片检查，以便早期发现和诊断铝骨病，探讨并制定铝骨病的防治措施。【参考文献】  1Urist MR, Delange RJ,Finerman GAM. Bone cell differentiation and gr

18、owth factors. Science, 1983,220:686.2Urist MR, Jwata H, Delange PL,et al. Bone morphogenesis in implants of insoluble bone gelatin. Proc Nat Acad Sci USA, 1973,70(12):3511.3Jian-Min Zhu,Huffer W,Allen CA. Effect of aluminum on bone matrix inductive properties. Kidney Int,1990,18:1141.4Okamoto.Muscle tissue reactons to implantation of bone matrix gelatin. Clinical Orthopaedics and Related Research, 1991,263:242.5Boyce BF,by