体外生物人工肝系统对暴发性肝衰竭兔的支持作

1、体外生物人工肝系统对暴发性肝衰竭兔的支持作【摘要】目的探讨培养肝细胞用于生物人工肝及其作为肝移植辅助支持手段的可能性。方法以培养人肝细胞和中空纤维反应器为主要材料构成体外生物人工肝系统，对D-氨基半乳糖诱导的暴发性肝衰竭(FHF)兔进行人工肝支持实验。结果尽管两组实验动物的存活时间没有明显差异，但支持治疗组兔的血清转氨酶、总胆红素和肌酐水平均低于对照组，肝组织病理检查见肝细胞坏死程度明显轻于对照组，实验所用肝细胞保持较好的活力和贴壁能力。结论所用体外生物人工肝支持系统已发挥出培养肝细胞的生物作用，能够部分代偿FHF兔的肝脏功能。【关键词】人工肝支持暴发性肝衰竭兔Effect of extrac

2、orporeal bioartificial liver support system on fulminant hepatic failure in rabbits WANG Yingjie, LI Mengdong, WANG Yuming, et al. Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038【Abstract】ObjectiveTo evaluate the possibility of using cultured human hepatocytes as a bioartific

3、ial liver, which is used as an adjuvant support in liver transplantation. MethodsThe experiment of extracorporeal bioartificial liver support system (EBLSS) based on cultured human hepatocytes and a hollow fiber bioreactor was carried out on fulminant hepatic failure (FHF) in rabbits induced by D-ga

4、lactosamine. ResultsThere was no difference in survival time between the experimental and control groups of rabbits, but in the supported rabbits significantly lower serum alanine aminotransferase, total bilirubin, creatinine and markedly milder hepatocyte necrosis than those in control animals were

5、 observed. In addition, good viability of human liver cells was noted in the experiment. ConclusionThese data indicate that this EBLSS has played the biologic role of cultured human hepatocytes, and would be capable of partly compensating the function of the FHF liver.【Key words】Artificial liverLive

6、r supportFulminant hepatic failureRabbit近年来新一代生物型人工肝的研究取得重大进展，有望成为肝衰竭患者等待肝移植的辅助手段，受到学者们的普遍关注1。但国内这一领域的研究尚未见报道。本研究在高密度培养肝细胞的基础上，用培养的肝细胞、生物反应器及辅助装置构成体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，并用暴发性肝衰竭(FHF)动物模型进行初步实验，现报道如下。材料与方法一、实验动物：日本大耳白兔，体重23kg，性别不限，由本校实验动物中心提供。二、兔FHF模型的制备：参照Blitzer等2介绍的方法，用D-氨基半乳糖(D-Gal，购自重庆医科大学)致死性剂量(1.

7、2g/kg)耳缘一次性注射制备兔FHF模型。三、FHF兔的人工肝支持：1.EBLSS细胞材料为混合球形聚集培养的人胎肝细胞和肝非实质细胞，量约1108个，培养两天后用于EBLSS。中空纤维型生物反应器管内腔容量约20ml，管外容量约24ml，中空纤维有效交换面积112.8cm2。使用Millipore超滤装置为辅助循环系统，系统管道及反应器内腔预冲肝素液，并用输液加热器控制温度在3739。2.体外循环通道的建立实验前3648小时，戊巴比妥钠30mg/kg静脉注射麻醉动物，股动、静脉插入医用F4号导管，约至髂外动、静脉处，缝合肌肉皮肤，包扎固定肢体，肝素堵管。3.体外循环及观察指标检查兔股动、静

8、脉插管通畅后，于体外循环前4小时制备FHF模型。随后另选健康兔，颈动脉插管放血灌入EBLSS管道内(量约30ml)，连接EBLSS与FHF兔动、静脉插管，建立体外闭路循环，以1520ml/分钟循环血液。抗凝剂为肝素，首剂150u/kg，维持量50u/kg，一次/30分钟。循环过程中定时由反应器外腔开口输注肝细胞培养上清液，每只约15ml。定时采兔血置CX-7 Beckman生化分析仪检测血清转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)和肌酐变化，并取肝组织行病理检查。四、EBLSS循环后肝细胞活力观察：以0.01%胰酶和0.1mmol/L的EDTA消化分离、分散聚集人胎肝细胞和肝非实质细胞，台盼蓝拒染试

9、验测定细胞活力。采用置被覆胶原培养板、24小时常规条件培养法，观察聚集肝细胞的贴壁能力。结果一、FHF兔存活时间：对照组5只FHF兔的存活时间分别为9.2、14.6、15.7、24.2、34.1小时，平均(19.69.7)小时。EBLSS支持组FHF兔中，1只意外死于EBLSS循环开始仅10分钟，其余4只死亡时间分别为11.4、14.9、24.2、25.1小时，平均(18.96.8)小时。由死亡时间看EBLSS支持组存活时间并未较对照组延长(P0.05)。二、FHF兔主要生化指标的变化：动态检测两组FHF兔血清部分生化指标变化发现，两组动物的ALT、TB、肌酐浓度在模型制备后10小时均逐渐升高

10、，但两组相差尚不十分显著。10小时以后，对照组兔ALT、TB和肌酐水平升高幅度加大，而同时相EBLSS支持组存活兔三项生化指标的增幅相对较小(13)。1实验FHF兔血清ALT变化2实验FHF兔血清TB变化3实验FHF兔血清肌酐变化三、两组FHF兔肝组织病理改变：5只对照组兔的肝组织病理改变均呈典型的急性肝坏死特征，主要表现为：肝小叶正常结构消失、肝索解离、肝细胞呈大片溶解性坏死、汇管区有大量炎性细胞浸润。人工肝支持组，除1例病理改变见大块肝坏死外，其余4只均表现为严重肝细胞变性、肝索排列紊乱、局灶性坏死，易见肝细胞再生现象(双核细胞增多)。四、EBLSS循环过程肝细胞活力变化：FHF兔人工支持

11、实验后，EBLSS所用肝细胞的活力和球形体肝细胞重新贴壁率较实验前均有所降低。其中，肝细胞活力平均下降13.1%，肝细胞重新贴壁率下降26.2%。讨论目前公认，肝移植是FHF的最有效疗法，但由于受自身病情和供体来源的限制，多数FHF患者难以在有限的时间内接受紧急肝移植。为此，国外学者长期致力于人工肝研究，以期做为等待肝移植的过渡支持手段。然而，早期的血液灌流、吸附等非生物型人工肝并未取得令人满意的结果。直至晚近，以培养肝细胞为主要材料的EBLSS的出现才给该领域的研究带来新的希望。越来越多的研究资料显示3，这种新型生物人工肝支持系统不仅具有肝特异性解毒代谢功能，而且具有生物合成功能，可为FHF

12、患者等待肝移植创造条件，争取时间。本研究在体外两步法分离获取高活性的人肝细胞后，采用综合限制贴壁技术加以高密度球形聚集培养4，随后置于中空纤维型生物反应器，构成简易EBLSS，对D-Gal诱导的FHF模型兔进行人工肝支持研究，生化分析显示，生物人工肝支持组动物的ALT、TB、肌酐的升高幅度得到一定的抑制，同时见支持组兔肝组织病理改变明显较轻，并有不同程度的肝细胞再生，提示EBLSS对D-Gal诱导的FHF动物有一定的支持作用。结合EBLSS体外功能评价结果(另文报道)分析，该保护作用既包括了培养肝细胞对D-Gal及诱导肝损害后所产生毒性代谢物的解毒作用，又有肝细胞及肝细胞培养上清液提供肝细胞再

13、生物质、促进肝细胞再生的作用。只因实验动物体外循环难度较大、实验条件不易控制、EBLSS对兔血液动力学影响过大而使EBLSS应有的支持治疗作用未能充分显现。注：本课题为国家“九五”攻关项目作者单位：王英杰李梦东王宇明陈国致刘国栋谭朝霞（400038重庆，第三军医大学西南医院）参考文献1Gerlach J, Ziemer R, Neuhaus P. Fulminant liver failure: relevance of extracorporeal hybrid liver support systems. Int J Artif Organs, 1996, 19: 7-13.2Blitzer BL, Waggoner JG, Jones EA, et al. A moldel of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology, 1978, 74: 664-671.3Hoffman A