重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及其纯化的研究

1、霉短狄孽¨：攀拳？。簟；硕士学位论，文。二。、。二摹缉人生长激素在大肠秤菌中分毋。表达及其纯化的研究。姓名何正祥学科专业研究方向指导教师完成时间生物化学与分子生物学基因工程与蛋白质工程张部昌教授马清钧研究员六年五月重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及其纯化的研究摘要在大肠丰丁菌中分泌型表达重组人生长膨素既有利于消除其在临床应用上的抗原性又有利于提取纯化，因此在重组人生长激素的大规模发酵生产中越来越受到青睐。本研究应用启动子与引导序列构建了高效分泌型表达重组人生长激素工程菌（），在摇瓶水平上，采用多因素正交优选法初步筛选培养基成分，进而考察葡萄糖对重组人生长激素表达量的影响。在此培养基

2、基础上优化诱导表达条件，分别考察了诱导起始菌密度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导表达时间对重组人生长激素表达量的影响。在摇瓶水平优化后进一步考察了工程菌在发酵罐水平目的蛋白的表达情况。在发酵罐中将工程菌（）进行补料式发酵，诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择，分泌表达重组人生长激素的量可达到，占周质蛋白的一，发酵周期缩短为小时。用纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱，一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的重组人生长激素，产物纯度达到以上，纯化产物在分子量大小、免疫活性和二硫键的形成上均与天然生长激素相一致。关键词重组人生长激素；大

3、肠杆菌；周质；发酵；亲和层析诹，删（），：；：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研冤成果。据我所知，除了又中特别加以标注和致谢的地方夕卜，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丑芭纸泥溅其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：畛。喈签字日期枷年主月，日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解央涉栽况有关保留、使用学位论文的规定，借阅。本人授蛳两以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

4、和磁盘，允许论文被查阅和检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）缩略词表缩略词表，氨苄吉霄素辛宁可酸碱基对牛血清白蛋白二甲亚飘乙二胺四乙酸甘氨酸人生长激素高压液相色谱异丙基硫代半乳糖苷千碱基对千道尔顿甲硫氨酸分钟相对分子量光密度外膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应苯丙氮酸重组人生长激素咖眦印一姗一圣妨腼雌一麟嗽枷棚哪宣辕分钟十二烷基硫酸钠三羟甲基氨基甲烷（）重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表盘及茛纯化的研究第一部分前言人生长激素（，），又称为促生长素（）是由个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子质量在左右，等电点为，分

5、子中存在两对二硫键，分别位于与之间和与之间。人生长激素是由人脑垂体前叶（）嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素，在人体内的生长激素是以的形式分泌，另外是以相对分子质量为的形式分泌。的人生长激素与的人生长激素的差别在于前者的第二编码外显子被从的原初转录本上多切除了个核苷酸序列。脑垂体在下丘脑肽生长激素释放因子的刺激下，便能释放生长激素，而生长激素抑制素（）则能抑制它的释放。人生长激素属于蛋白质类激素，不通过靶腺产生生理效应，它的受体遍及全身。人生长激素含有两个受体结合位点，一个是高亲和性的，另一个则是低亲和性的。在活跃的信号转导复合物中，生长激素按顺序同两个受体分子结合，而突变的生长激素

6、由于失去了一个低亲和性的结合位点，而无法激活信号转导。的作用机理一般认为是通过进行的，在与靶细胞膜上特异性受体结合后，改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。人生长激素对几乎人体所有组织（除神经组织外）都有促生长功：能，还能促使脂肪、糖类的降解，增进蛋白质和核酸的合成。其在临床上主要用于治疗儿童白发性垂体性侏儒症（），疗效显著且安全。随着对人生长激素研究的深入，发现生长激素的变化与人体免疫功能、循环系统、泌尿系统、抗衰老和血糖调节等均有密切关系【，们。近年来，临床上将生长激素的应用范围逐渐扩展到了严重烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、第一部分前言骨质疏松、

7、肥胖以及男性衰老等疾病。生长激素的种族特异性很强，动物的生长激素人类是不能应用的，只有人类自身的生长激素才具有临床治疗功能。因此过去临床应用只能从人脑垂体提取，来源十分有限，价格也非常昂贵。因为人脑垂体中生长激素的含量只占干重的，从人的一个垂体中最理想的情况下也只能制得的人生长激素。到了上世纪年代后期随着分子生物学的发展，特别是基因工程技术的发展，使得利用基因工程手段大规模生产重组人生长激素（，）成为现实，。重组人生长激素即为重组技术生产的由个氨基酸组成的，其结构和氨基酸序列与天然人生长激素（）一致的基因工程药物。年美国批准公司利用基因技术生产的重组人生长激素，用于治疗儿童生长激素缺乏，临床上

8、的应用表明它是治疗内源性生长激素缺乏或不足导致的身材矮小的特效药。其需求量和销售额在基因工程药物中均位于前列【。应用重组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径：一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。而在大肠杆菌中表达胞内型重组人生长激素，需要经过相当复杂的步骤，才能从数于种胞内蛋白质中分离纯化出来。这不仅延长了生产周期，而且增加了生产成本。此外，天然的生长激素（）的氨基末端是苯丙氨酸，而不是甲硫氨酸，它已经在生长激素合成之后的加工过程中被切割掉了。但是，以可溶性的或包涵体形式表达即胞内表达的重组人生长激素其氨基端比天然的生长激素多了一个甲

9、硫氨酸，它是大肠杆菌胞内酶体系所无法切割的，人应用这种类型的生长激素后易产生抗体，。为克服这一缺点，我们将带有引导序列的片段克隆到原核高效表达载体（）上，在大肠杆菌）中表达前生长激素（），在的引导下，通过细胞内膜的同时脱去引导肽（），成为成熟的，其一级结构与天然人生长激素完全一致，且定重塑圭篓壁鲞垄奎墅堑堕！坌塑耋竺墨茎丝些塑堡壅位在细胞周质，既有利于消除临床应用上的抗原性，又有利于提取纯化【屯。与细胞质相比，在周质中表达具有多方面的优点。首先，存在于周质中的蛋白质种类很少，仅占细胞总蛋白质的，大约为种，所以在周质中表达的能够破有效的浓缩和纯化，表达量可占周质蛋白的；其次，由于周质的氧化环境有

10、利于蛋白质按正确方式折叠，故在周质中表达能够以可溶性的、正确折叠的活性形式存在，不需要重新折叠以形成正确的二硫键和空间结构，简化了后期的纯化步骤；最后，在周质中蛋白质的降解作用也不如细胞质中的那样广泛，故表达外源基因的产物不易被降解。本研究应用启动予与引导序列构建了高效分泌型表达重组人生长激素工程菌（），采用多因素正交优选法初步筛选培养基成分，进而考察葡萄糖对重组人生长激素表达量的影响。在此培养基基础上优化诱导表达条件，分别考察了诱导起始菌密度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导表达时间对重组人生长激素表达量的影响。在摇瓶水平优化后进一步考察了工程菌在发酵水平目的蛋白的表达情况。在发酵罐中将工程菌一（

11、）进行补料式发酵，诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择，分泌表达重组人生长激素的量可达到，占周质蛋白的，发酵周期缩短为小时。在表达产物纯化方面，首先裂解工程菌获得周质蛋白，再从周质蛋白中纯化目的蛋白。传统的工艺采用高渗和低渗【，州两步裂解得到周质蛋白，然后通过等电点沉淀、硫酸铵沉淀、超滤、离子交换层析和疏水层析等步骤纯化捌这种纯化工艺由于程序烦琐和目的蛋白得率低的缺点而有待于改进。本文采用高渗和溶菌酶的方法一步裂解细胞提取周质蛋白，比传统的两步裂解工艺要简单快捷，并且裂解液的接近中性可直接上亲和层析柱。抗体亲和层析一步纯化高纯度的活性

12、，具有特异性好、操作简便和产物得率高等特点嘲，并且纯化产物在分子量大小、免疫活性和二硫键的形成上均与天然生长激素相一致。第二部分材料与方法第二部分材料与方法材料菌种一，大肠杆菌（）（。）（）：。（），军事医学科学院生物工程研究所保存。质粒（），军事医学科学院生物工程研究所保存：，克隆载体，含有基因，军事医学科学院生物工程研究所保存；，本文构建：，本文构建。培养基液体培养基：用于大肠杆菌的培养，加入蒸馏水，再用备用。，（约）调至后高压灭菌固体培养基：每液体加琼脂粉，高压灭菌保存。带质粒菌株的培养需加抗生素，如的氨苄青霉素。缓冲液缓冲液：缓冲液：，几，。兰望兰堡堂茎垄盔墅堑堕±坌鲨塞坠丝

13、苎丝丝堕旦窒碱，冰乙酸，（），加双燕水至升备用。琼脂糖凝胶电泳用×缓冲液。×蛋白质电泳上样缓冲液，硫苏糖醇，溴酚蓝，的甘油。电泳缓冲液碱，甘氨酸（电泳级），。可配成×贮存液备用，在去离子水中溶解碱和甘氨酸，然后加入（）的电泳级贮存液，用去离子水补至贝成×贮存液。考马斯亮蓝染色液甲醇：水（：，）和冰乙酸的混合液中溶解考马斯亮蓝，用号滤纸过滤染色液以除去颗粒状物质。脱色液甲醇，冰乙酸，再用去离子水补至。细胞裂解缓冲液溶菌酶，（）蔗糖，（），（），现配现用。磷酸盐缓冲液（），溶解于去离子水中，用调节至则成。，甘油，醇。工具酶限制性内切酶，为、公司产品：转移缓冲

14、液第二部分材料与方法连接酶，为、公司产品；聚合酶，为上海生工公司、公司产品；聚合酶，为上海生工公司、公司产品；溶菌酶，为公司产品。抗体免抗人生长激素抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗免（叶），均为北京中山生物技术有限公司产品。试剂及试剂盒抗生素：氨苄青霉素（，市购）。质粒纯化试剂盒（），产物纯化试剂盒（），片段纯化回收试剂盒（，），均为公司产品。分子量标准：，、，均为公司；低分子量蛋白质标准公司产品。葡萄糖测定试剂盒。为北京利德曼生化技术有限公司产品。蛋白质定量试剂盒：该包含标准品、盐溶液及溶液，为公司产品。蛋白质质银染试剂固定液：无水乙醇冰醋酸加水至终体积；增敏液：无水乙醇戊二醛（）硫代硫酸钠

15、（）乙酸钠里丝皇墨塑鲞垄查堑堑堕！坌塑墨鲨墨茎丝些塑竺塞加水至终体积：银染液：硝酸银溶液（）甲醛（）加水至终体积；显色液：碳酸钠甲醛（）加水至终体积：终止液：加水至终体积；保存液：甘油（）。加水至终体积蛋白纯化试剂、和均为产品。培养基试剂和为公司产品：琼脂粉为公司产品。生化试剂为公司产品：为上海联合赛尔生物工程有限公司产品；弗氏佐剂为北京鼎国生物技术公司产品；电泳琼脂糖为公产品；丙烯酰胺和一亚甲撑双丙烯酰胺为公司产品；为公司产品；显色系统为公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯。仪器设备蛋白质纯化系统：盯产品；仪：（）；离心机：（一），（）；第二部分材料与方法电泳仪：北京六一仪器厂（型）；半于电

16、泳转移仪：公司产品：酶联免疫检测仪：（）分光光度计：虢咀）洗片机：（）发酵罐（）：上海保兴生物设备工程有限公司产品。实验动物雄性适龄家兔，由军事医学科学院实验动物中心提供。方法大肠杆菌质粒的小量提取参照质粒提取试剂盒（）说明书进行。接种大肠杆菌于培养基，在振荡培养踮小时，取菌液，离心去除上清液，加，细胞悬浮液（）将沉淀细胞充分悬起后，加细胞裂解液（）翻转次混匀，室温放置约分钟，使混合液完全澄清。向裂解液中加碱性蛋白酶液（），翻转次混匀后再放置分钟。加中和液（），充分混匀后离心（，分钟），上清液转移到树脂小柱中，离心（，分钟），树脂柱用洗柱液（）洗涤两次（此和），最后用无核酸酶水或溶液将质粒从树

17、脂柱上洗脱下来（约肛）。大肠杆菌感受态细胞的制各和转化接种大肠杆菌于培养基中振荡培养过夜，按的比例接种培养基，振荡培养小时。冰浴冷却分钟后，离心（，分钟）收集菌体，将菌体悬浮于用冰水浴预冷的溶液中，再次离心收集菌体，并悬浮于冷的溶液中备用。向大肠杆菌感受态细胞悬浮液中加入连接产物（或止质要塑兰篓塑室垄奎墅堑堕！坌篓茎垄墨茎丝些竺竺墅粒）溶液，用手指轻轻弹几下后放冰水浴分钟，转入。水浴热刺激秒钟，再置于冰水浴分钟，加入培养基后，。保温分钟。最后将转化菌液除含氨苄青霉素的平皿。挑菌落进行阳性克隆筛选鉴定。的限制性内切酶的双酶切按厂家产品说明书进行。鉴定性酶切，反应体积为；需回收片段酶切，反应体积为

18、。在双酶切反应中，应选择对两种酶都有效的缓冲液。以“反应体系为例，其它体积的反应体系依据倍数而变化：×限制内切酶限制内切酶皿皿（）温育小时（酶切鉴定）或过夜（基因的连接克隆）。片段的连接按产品说明书进行，一般情况下，反应体系中插入片段与线性质粒的摩尔比约：，在连接小时（一般连接酶）或小时（快速连接酶）。电泳分离采用琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小配制琼脂糖浓度为，在琼脂糖中加入溴化乙锭，使其终浓度为，：，电泳时电压控制在。观察或拍照时在的紫外光下操作，从凝胶上回收样品时在的紫外光下操作。片段的回收和纯化苎三堡坌塑壁皇查鲨用公司的回收纯化试剂盒（）进行，样品用琼脂糖凝胶分离后，在的紫外光下

19、切下的胶块（）放入管，加树旨），翻转次后室温放置分钟，至胶块完全溶解消失。用一次性注射器将树脂注入小柱，再用异丙醇洗柱次。离心（，分钟）完全去除小柱中的异丙醇，加此的缓冲液浸泡小柱分钟。若片段很大，事先将缓冲液在。水浴预热。最后离心收集样品。扩增）反应成分：酶或酶模板。肛总体积“（：用于基因的克隆、融合：阳性质粒的鉴定；阳性克隆的鉴定用灭菌吸头接种菌落即可，无须加纯化质粒）扩增条件：先将混合物在。变性解链，再进行循环扩增：秒。一。秒；，秒；以上程序重复个循环，最后延伸。保存。重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及茛纯化的研究蛋白质的诱导表达表达重组蛋白均采用（）一（）原核表达系统。（）在宿主菌中

20、均可通过调整诱导浓度束实现对表达水平的紧，蛊，控制。新接种的细菌。摇床培养至一。转移少量菌液作为非诱导对照。其余加入并使其终浓度为。继续诱导培养。菌液在，离心。沉淀的细胞团用于分析或一。保存待用。表达产物的鉴定及表达水平分析工程菌经诱导适当时间后，取菌液离心收集菌体，弃上清，加水，充分悬浮菌体，加上样缓冲液，置沸水中加热分钟，离心后取山上清进行电泳。电泳积层胶，分离胶，具体操作见分子克隆。电泳结束后，用考马斯亮兰染色小时以上，脱色液脱色。用扫描仪将胶扫描，再利用天能图象分析软件对目的条带进行定量分析，详细步骤见产品说明书。蛋白质存在性质的鉴定）取诱导的培养物，离心，收集上清转移到另一只微量离心

21、管中。加入（体积）的（）到上清液中，摇匀秒。冰上放置，离心。收集离心沉淀物。用丙酮悬浮沉淀，离心，如此重复两次。吸弃丙酮，真空抽干，使得其中的丙酮充分挥发完。往沉淀中加入×蛋白上样缓冲液，沸水浴，离心，取上清进行电泳。）取诱导的培养物，离心收集菌体，加入的缓冲液，冰浴分钟后，冰浴中超声破碎（个循环，的时间间隔）。取裂解物。离心分离上清和沉淀轻轻倾出上清，即为可溶性组分，沉淀即为胞内不溶性组分。可溶性组分加入等体积的上样缓冲液，不溶性组分加入×上样缓冲液。均置沸水中加热墨三墅坌塑型皇互望分钟，离心后取上清进行电泳。取诱导的培养物，离心，收集沉淀。加入“新鲜配制的细胞裂解缓冲液

22、充分悬浮沉淀，冰上放置，。离心，上清中即为细胞的周质蛋白。取上清加入等体积的上样缓冲液，混匀，沸水中加热分钟，离心后取“上清进行电泳。重组蛋白在摇瓶水平表达条什的优化）利用正交优选法确定培养基成分对重组蛋白表达量的影响正交优选法的设计工程菌培养基的基本成分为：，。在此基本成分的基础上影响目的蛋白表达量的培养基因素主要有：磷酸盐（±）（）、（）和乳糖（）的用量。以这三个因素作为考察对象，以目的蛋白表达量（培养液）作为考察指标，对个影响因素各取个位级，选用（）正交表进行实验，以确定最佳培养基成分。因素位级表见表。表。工程菌培养基成分优选位级表在不同培养基中培养的工程菌目的蛋白的表达将序列

23、测定正确的重组质粒转化大肠杆菌（），挑取单克隆接种于含氨苄青霉素的培养基中，活化过夜，按接种量接种至娟号（见表）不同编号的培养基（含氨苄青霉素）中，均振荡培养后，加入诱导剂进行诱导并使其终浓度为，诱导表达。里塑竺堡堂耋垄盔暨堑堕！坌鳖墨竺墨苎塾些盟堕窒诱导表达条件的优化诱导起始菌密度对工程菌目的蛋白表达量的影响重复以上步骤而将工程菌接种至经正交优选法筛选出的最佳培养基（含氨苄青霉素）中，培养不同时间后开始诱导，加入相同浓度的诱导剂在相同温度下诱导表达相同时间。分离的周质蛋白通过确定最佳诱导起始菌密度。诱导温度对工程菌目的蛋白表达量的影响重复以上步骤而改变诱导温度，待工程菌在培养一定时间后，加入

24、相同浓度的诱导剂在不同温度下诱导表达相同时间。分离的周质蛋白通过确定最佳诱导温度。诱导剂浓度对工程菌目的蛋白表达量的影响重复以上步骤而改变诱导剂的浓度，待工程菌在培养一定时间后，加入不同浓度诱导剂进行诱导在相同温度下诱导表达相同时间。分离的周质蛋白通过确定最佳诱导剂浓度。诱导时间对工程菌目的蛋白表达量的影响重复以上步骤而改变诱导时间，待工程菌培养在培养一定时间后，加入相同浓度的诱导剂在相同温度下诱导表达不同时间。分离的周质蛋白通过确定最佳诱导表达时间。工程菌的发酵）发酵培养培养体积为，控制在士，由发酵控制系统自动补入和调节培养基。培养温度控制在。发酵过程中溶氧控制在以上，当溶氧降低至该值时可通

25、过提高通气量和搅拌速度以提高溶氧。）诱导和补料发酵当发酵进行到后，待培养基中的葡萄糖消几乎耗完，一次性加入使其终浓度为进行诱导，同时以，的流速滴加补料液，补第二部分材料与方法料体积为。蛋白质的定量采用公司的蛋白质定量试剂盒测定。其基本原理是：利用蛋白质的肽键与在碱性环境下还原生成四配位基复合物，该复合物再与辛宁可酸（，）反应，生成紫色的复合物，其最大光吸收破长为。由于蛋白质的量同其分子数相对应，因此，以牛血清白蛋白质（）作对照在一定范围内便可很方便地通过酶联免疫仪对蛋白质进行定量。具体操作如下：将液与液以：的比例混合均匀配制成工作液。将待测样品用水稀释适合浓度，以每孔加入酶联板中。取稀释成系列

26、梯度的标准蛋白质（浓度范围：岭），也加入孔酶联板中。在每孔中加入工作液，混匀。盖上盖子放置，室温放置分钟后用酶联仪在处检测。制作标准蛋白质浓度曲线，从而读取待测蛋白质的浓度。兔抗多克隆抗体的制备用上海联合赛尔生物工程有限公司生产的注射用重组人生长激素免疫兔子，每月免疫一次，免疫次，每次免疫剂量为。第一次用弗氏完全佐剂，其余两次用弗氏不完全佐剂。末次免疫后天，耳缘静脉取血免疫双扩散测定抗体效价。确定抗体达到一定效价后，心脏取血，离心分离血清。用离子交换及分子筛两步纯化抗体。抗体效价测定免疫双扩散法沸水浴使得琼脂糖充分溶解，取均匀的浇于的载玻片上，冷凝后，置于湿盒中保存过夜。打孔，打成梅花状，直径

27、。梅花状的中心孔加入一定浓度的抗原，周边加入不同稀释度的抗体：、：、：、：、：。温育和小时，观察抗原孔与不同稀释度的抗体孔之间有无沉淀线出现。重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及莨纯化的研究蛋自质纯化）抗体亲和层析杠的制备：参照产品说明书进行。凝胶的处理：称量所需的凝胶，按每克凝胶膨胀后的终体积称取，用悬浮，在玻璃砂滤器中用洗涤约分钟，使用量为的每克凝胶干粉；在的碳酸盐缓冲掖（含，）中溶解抗体，大约的抗体溶液每克凝胶干粉，使最终的抗体含量为每毫升的凝胶含的抗体，室温下摇匀越小时；用倍凝胶体积的的碳酸盐缓冲液（含，）洗去未结合到凝胶上的抗体蛋白；封闭仍有活性的配基：将混匀的凝胶转移到）中，放置小

28、时，使得活性配基水解；装柱：按常规装好层析柱；洗柱；用的乙酸盐缓冲液（含（含，）洗个柱体积，然后用，）洗个柱体积，如此重复三个循环：平衡：用个柱体积的的过柱平衡，保存备用。）样品制备取诱导的培养物，离心，收集沉淀。加入，新鲜配制的细胞裂解缓冲液充分悬浮沉淀，冰上放嚣离心，上清中即为细胞的周质蛋白，可直接上柱。）蛋白质纯化平衡：用（）以的流速过柱，大约平衡个柱体积；上样：以的流速上样：洗柱：用（）以的流速洗柱，洗去未结合到柱子上的杂蛋白，在紫外检测仪的监测下，当。小于时，继续平衡个柱体积，直到￥接近时开始解离结合在柱子上的目的蛋白；解离：用（）缓冲液解离结合到柱子上的目的蛋白，流速为。在的紫外检

29、测下，当起峰时收集洗脱峰，直到。小于时停止收集：再生：继续用（）缓冲液洗柱巧个柱体积，再用（）平衡个至三堡坌堑登皇查鲨杠体积，柱子再生后于。保存备用：收集的洗脱峰用的调节至中性，于。透析或超滤。免疫印迹试验根据公司推荐程序进行：对待测蛋白质样品对称进行常规电泳分离后，将凝胶的浓缩胶切除，分离胶对称切开，一半直接在考马斯亮兰染色，另一半置于转移缓冲液中和硝酸纤维素膜一起浸泡，然后在半干电泳转移仪上伏转移“，将蛋白质转移到硝酸纤维膜上；转移好的硝酸纤维素膜，用封闭液（，或，脱脂奶粉）在脱色摇床上封闭小时。在抗体稀释液（封闭液）中按：稀释兔抗人生长激素抗体，室温孵育，用（，）洗三次，每次分钟。在抗体

30、稀释液中按：稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（），室温孵育，按照公司推荐程序进行，具体如下：固定：将凝胶置固定液固定分钟；增敏：用增敏液增敏分钟；去离子水洗涤次，每次分钟；银染：用印染液染色分钟；去离子水洗涤次，每次分钟；显色：显色液显色分钟；终止：终止液终止分钟；去离子水洗涤次，每次分钟；用保存液处理分钟。洗液漂洗三次，每次分钟。用显色系统使光片感光，获得显色条带。蛋白质银染纯度分析荤组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及其纯化的研究第三部分分泌型表达质粒的构建及其鉴定引言应用重组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径：一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型

31、的重组人生长激素。在大肠杆菌中表达胞内型重组人生长激素，需要经过相当复杂的步骤，才能从数千种胞内蛋白质中分离纯化出来。这不仅延长了生产周期，而且增加了生产成本。更重要的是，以可溶性的或包涵体形式表达即胞内表达的重组人生长激素其氨基端比天然的生长激素多了一个甲硫氨酸，它是大肠杆菌胞内酶体系所无法切割的，人应用这种类型的生长激素后易产生抗体，】。因此优选的表达系统是将大肠杆菌表达的分泌到细胞周质，就可以获得可溶性的和正确折叠的活性蛋白。这样既有利于消除临床应用上的抗原性，又有利于提取纯化】。首先，存在于周质中的蛋白质种类很少，所以在周质中表达的能够被有效的浓缩和纯化，表达量可占周质蛋白的；其次，在周质中表达以可溶性的、正确折叠的活性形式存在，不需要重新折叠以形成正确的二硫键和空间结构，简化了后期的纯化步骤；最后，在周质中蛋白质的降解作用也不如细胞质中的那样广泛，故表达外源基因的产物不易被降解。我们将带有，引导序列的片段克隆到原核高效表达载体（）上，在大肠杆菌（）表达前生长激素（），在的引导下，通过细胞内膜的同时脱去引导肽（），成为成熟的，其一级结构与天然人生长激素完全一致，且定位在细胞周质。结果和分析分泌型表达质粒的构建第三部分分泌型表达