老年性痴呆动物模型的研究进展

1、第26卷第1期2009年2月实验动物科学LABORAT ORY ANI M A L SCIE NCE V ol.26N o.1February 2009综述进展老年性痴呆动物模型的研究进展文彪叶冰董青青黄国钧(成都中医药大学,成都610075关键词:老年性痴呆;动物模型;研究进展中图分类号:R74911文献标识码:A 文章编号:1006-6179(20090120045204收稿日期:2008208211作者简介:文彪(1983-,男,硕士研究生。研究方向:中药药理与毒理研究。指导老师:黄国钧教授。叶冰(1976-,女,讲师,博士研究生。研究方向:中药药理与毒理研究。指导老师:黄国钧教授。老年

2、性痴呆(senile dementia ,S D ,亦称阿尔茨海默病(senile dementia of Alzheimer type ,AD ,是一种以临床和病理为特征的进行性、退行性神经病变。研究发现,65岁以上者老年痴呆症发病率约为1%,而85岁以上者约达30%1。预计2025年后全球将有2200万人患上AD ,到2050年患此疾病的人数将达4500万,AD 将成为人类社会的流行病,防治老年性痴呆疾病是当今老年疾病研究领域的最重要前沿课题之一2。S D 的病理机制非常复杂,病因尚不清楚。近年来,在研究并建立可靠的老年性痴呆动物模型等基础研究领域取得了一些可喜的成绩,对于探明AD 的病因

3、、发病机制及防治药物的研究与开发均具有重要的意义34。现将有关AD 动物模型的研究进展综述如下。1三氯化铝致鼠痴呆模型111基本原理本法以AD 的铝中毒假说为基础,常选用大鼠或小鼠使用过量的铝诱导建立AD 动物模型4。112模型制作方法11211小鼠腹腔注射法:K M 小鼠,体重(30±4g ,12月龄,雄性。用AlCl 3溶液100mg kg 腹腔注射,隔日一次,连续50d5。11212小鼠灌胃给药法:K M 小鼠,体重(30±4g ,12月龄,雄性。每日上午以AlCl 3溶液200mg kg 剂量灌胃给药,共90d6。江等7选用NIH 小鼠,将AlCl 3配制成浓度为8

4、g 100m L 的溶液,每日上午以800mg kg 灌胃给药,共90d 。11213大鼠颈背部皮下注射法:S D 大鼠,体重(300350g ,雄性。在大鼠颈背部皮下注射pH 值为615的115%的AlCl 3溶液60m L kg ,每日1次,连续20d8。11214大鼠灌胃给药法:Wistar 大鼠,体重(200220g ,雄性。按每天灌服AlCl 3500mg kg ,共30d 9。113观测指标有学习、记忆错误次数及潜伏期、海马及脑皮层M 受体亚型的含量、小鼠部分脑区中的铁及铁蛋白的分布变化、小鼠海马C AI 区神经元形状特征参数、行为学指标、超氧化物歧化酶(S OD 和还原型谷胱甘肽

5、酶(G SH 2PX 活性、丙二醛(MDA 含量及海马内2APP 阳性神经元的数量等。以及脑皮质神经元内钙离子浓度及细胞的凋亡率等7。22淀粉样蛋白(A 致大鼠痴呆模型211基本原理本法以AD 的主要神经病理特征是大脑皮质萎缩、细胞外存在大量由2淀粉样蛋白(A 组成的老年斑(SP 、神经细胞内的神经纤维缠结(NFT 以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性10为依据,常选用大鼠使用2淀粉样多肽2535片段(A 2535于海马双侧注射诱发AD 动物模型11。臧艳平等12则将A 140定向注入大鼠左侧海马C A1区制作AD 动物模型。212模型制作方法S D大鼠,10月龄,体重(280320g。A25

6、35用无菌生理盐水配制成2gL,-20保存。实验前将A2535溶液在37保温箱中放置7d以形成聚集态的A2535。模型组大鼠用30gL的戊巴比妥钠(40mgkg麻醉后,头顶去毛,消毒皮肤并切开,在颅骨上用牙钻对称打两个孔(AP-315mm, M L±210mm,DV217mm即为海马区注射点,每侧注射5L(10g聚集肽的A2535,在5min内注完,并留针3min。用牙托粉填补针孔,缝合皮肤并消毒。对照组在海马内注射等量的生理盐水。单笼饲养至大鼠完全清醒。术后第8d开始行为测试,测试结束后进行病理检查。也有研究者12选用雄性Wistar大鼠,选择左侧海马C A1区为注射靶区(前囟后3

7、10mm,中线左侧旁开212mm,硬膜下218mm,采用微量注射器将1L A溶液缓慢注入,留针5min以保证溶液充分弥散后缓慢撤针。213观测指标跳台实验法、穿梭实验法、M orris水迷宫法及脑组织病理改变。大鼠左侧海马区BSI2B4与G FAP以及I L21T NF表达阳性细胞数12。3D2半乳糖拟脑衰老模型311基本原理本法以D2半乳糖(D2gal使机体的代谢紊乱,尤其是糖蛋白质的代谢异常,影响机体正常代谢,以出现衰老特征表现为依据,常选用小鼠使用D2gal于颈部皮下注射诱发AD动物模型。312模型制作方法K M小鼠,雄性,体重(20±2g。每次分别将5只小鼠分置于跳台仪的5个

8、隔间内,第1次将5min内未能跳上跳台、在隔间内躁动不安者及啃咬电栅者淘汰;间隔4h重试,方法同上。第2次将受电击后跳上跳台5min内未跳下者淘汰。筛选后以D2gal80mgkg颈部皮下注射,然后012m L蒸馏水灌胃13。313观测指标主要为生命活动状态和学习记忆能力。4双侧大脑基底神经核电损伤模型411基本原理本法是对老龄大鼠双侧大脑基底神经核使用电极损伤,造成学习和记忆功能障碍的AD动物模型。412模型制作方法S D大鼠,22月龄(老龄,雄性。大鼠腹腔注射2%异戊巴比妥(35mgkg麻醉,除去颅区鼠毛,将大鼠固定在脑立体定位仪上,采用K oenlng图谱,进行双侧大脑基底神经核定位(前囟

9、前012mm、旁开215mm。用笔式开颅钻钻切双侧颅骨,取下颅骨片,显露硬脑膜。用无菌针状电极,从硬脑膜表面开始,向其深面垂直进针7mm,针电极尖端达大脑基底神经核。用导线牢固连接直流稳压电源、电流控制器、定时器、万用表、不锈钢电极夹。将一个不锈钢电极夹夹在术区切口的皮肤上,另一个(正极夹在针状电极的尾端。打开稳压电源开关,开启定时器,调节电流控制器输出,用1mA直流电刺激30s,缓慢提出针状电极。用相同方法损伤大鼠的另一侧大脑基底神经核。从造模后第7d起,对大鼠进行测定,直到学会上安全台为止。测定结束后处死,取脑作淋巴细胞增殖水平与脾细胞抗体产生能力检测14。413观测指标观测指标有学习与记

10、忆功能、淋巴细胞增殖水平15及脾细胞抗体产生能力等。5中枢神经抑制药致小鼠记忆障碍模型511基本原理本法以中枢神经抑制药樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱、或戊巴比妥钠腹腔注射模拟AD出现的记忆障碍或方向辨别障碍症状而得。512模型制作方法51211樟柳碱腹腔注射法:小鼠腹腔注射樟柳碱10mgkg体重。51212氢溴酸东莨菪碱腹腔注射法:小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2mgkg体重。51213戊巴比妥钠腹腔注射法:小鼠腹腔注射戊巴比妥钠115mgkg体重。513观测指标主要有触电潜伏期与错误次数、避暗潜伏期及5min内错误次数、平均反应百分率和正确反应平均数等1617。64实验动物科学26卷6兴奋性氨基酸基底

11、前脑注射致学习记忆障碍模型611基本原理本法采用兴奋性神经毒剂鹅膏蕈氨酸(I2botenic acid,I BO基底前脑注射,造成大鼠学习记忆障碍模型。612模型制作方法S D大鼠,3月龄。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,脑立体定位仪固定,平颅头位,按大鼠脑定位图谱,在AP(前囟前:-018mm,M L(中线旁: 310mm,DV(自脑表面深度:710mm,双侧注射1L I BO(10gL,溶于生理盐水中。613观测指标动物学习记忆能力与旷场分析18。邱幸凡等19单独应用I BO定位注射至大鼠胆碱能神经元聚集的Meynert基底核建立了模型,观察了对大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT和乙酰胆碱(

12、Ach活性的影响,结果模型组大鼠海马区的ChAT和Ach活性均显著减小。陆珊等20研究了模型大鼠突触后致密区蛋白95(PS D95和骨架蛋白Shank1的表达。7D2半乳糖合并Meynert基底核损毁模型711基本原理本法在D2半乳糖致亚急性衰老基础上合并I BO 损毁Meynert核(nbM,其多因素的模型设计可能更符合AD的复杂病理特征。712模型制作方法71211Wistar大鼠,15月龄,雌性。腹腔每天注射D2半乳糖(48mgkg,共6周。再在脑内双侧Meynert核(定位坐标为前囟后018mm,中线旁开216mm,深812mm注射I BO,每侧注射5g21。71212Wistar大鼠

13、,20月龄。腹腔每天注射0196% D2半乳糖(5m Lkg共6周,然后用I BO(5gL损毁双侧nbM。713观测指标与结果M orris水迷宫行为检测、海马C A1区突触结构参数的变化、海马齿状回LTP的变化(电生理学、脑组织中2AP的含量、放免指标、ChAT和Ach活性等22。8D2半乳糖合并双侧海马损毁模型811基本原理喹啉酸(Quinolinic acid QA是脑内潜在的内源性毒素。海马是对QA最敏感的脑区,过量的QA激活其C A1区的N2甲基2Dd门冬氨酸(NMDA受体,不仅兴奋神经细胞使突触后去极化,同时又可刺激G lu的释放,形成恶性循环。G lu受体具有不易脱敏的性质,大量

14、的G lu往往引起细胞去极化和过度兴奋。因海马C A1区大量G lu能神经元肿胀坏死, NMDA受体破坏,加之M受体结合位点Rc下调,故表现类痴呆的学习记忆障碍。本法将其和D2半乳糖拟脑衰老模型结合起来,造成了一种较好的AD 模型。812模型制作方法Wistar大鼠,体重(200±20g,雄性。腹腔每天注射D2半乳糖50mgkg,连续8周。行为学测试后(验证造模成功与否进行脑内注射QA,大鼠于前囟AP012mm、M L215mm、DV715mm,注射1L浓度为75nm olL(25105mg2m L0101m olL P BS液体于海马C A1区,垂直进针,注射5min,留针3min

15、23。813观测指标主要是胆碱酯酶、单胺氧化酶活性及52HT的含量,目前较深入研究的指标是大鼠海马C A1区神经元突触超微结构的改变24。9APP转基因小鼠模型911基本原理AD的基本病理表现在大脑皮层和海马结构的2淀粉样斑块。斑块的主要成分是由2淀粉样前体蛋白(2APP衍生的3842个氨基酸的有神经毒性的多肽(A,A4。APP有多种剪接形式,其中695、751、770为主要形式。在M17成纤维细胞瘤细胞中发现V717I突变可增加A(142与A(140的比例,而前者正是选择沉淀在斑块核心的主要成分。PDG F启动子具有神经组织特异性,调控目的基因在转基因鼠的表达部位与AD的病变部位一致。因此,

16、选择PDG F启动子调控全长突变APPcDNA可造成APP转基因小鼠模型。74第1期文彪等:老年性痴呆动物模型的研究进展912模型制作方法构建含有全长突变的人APP cDNA695V717I受控于PDG F启动子调控的质粒pPDAP695。质粒pPDAP695的Tth+Xba的酶切片段为411kb,透析袋法进行回收。氯化铯超离纯化,于20、40000 rmin离心48h。分步收集,将含有DNA的溶液合并,在注射缓冲液中透析。注射缓冲液内含715mm olL T ris(pH714与01175mm olL E DT A。再转基因操作后,完成转基因鼠的鉴定及传代建系2526。913观测指标脑神经细

17、胞A表达水平。除上述模型外,还有自然衰老动物模型2729,自身免疫损伤模型等30。最近有学者使用低亲和性神经生长因子(NG F受体的单克隆抗体IgG与同样带有NG F受体的细胞毒性Saporin结合,制成了具有对胆碱能神经元有选择性的免疫毒素192IgG aporin。此免疫毒素所致胆碱能免疫损伤是使大鼠特异性胆碱能缺损的有用工具。另有中国医学科学院有关人员已研究出转APOE基因的小鼠模型,目前正处在模型完善阶段,有望为我国AD病研究提供有利条件31。目前,在抗老年性痴呆的药物研究中,使用铝制剂等损害致衰老动物模型的较多。但该类模型的不足之处是不出现老年斑、神经元纤维缠结和淀粉样蛋白沉积等AD

18、最典型的组织病理学特征,也无AD 病人全身多系统功能衰老的表现32。因此,用损毁方法建立的模型与AD尚有较大的差距。自然衰老动物模型极少形成典型组织病理学特征。多数转基因动物模型观察到病理变化,其中也有少数模型有学习记忆功能障碍。然而转基因动物模型由于制作复杂,成本较高,在实际应用上也受到一定的限制。因此,我们在研究治疗老年性痴呆病的药物时,应依据不同药物选择不同动物品系、性别,针对目标疾病选择病因、病理或基因动物模型,做到全面、系统、合理、科学评价药物的疗效与作用机理,更好地为临床服务。参考文献1He L,Liu G Q.E ffects of various principles from

19、 Chineseherbalmedicine on rhodam ine123accumulation in brain capillary endothelialcells.Act a Pharmacol S in,2002,23(7:59112蔡如鹏.世纪顽疾:老年痴呆症.中国新闻周刊,2007,(1:5455.临床药理学与治疗学,2004,9(3:249252.中医学院学报,2003,19(1:5815张雪飞.氯化铝中毒小鼠不同脑区M受体含量的比较观察.青海医学院学报,2002,23(1:1012.6孙强三,王晓红,徐青.痴呆模型小鼠脑组织铁及铁蛋白分布、海马CA1区神经元形态学改变的实

20、验研究.中国老年学杂志,2005,25(9:1092109317江,何玉萍,邹衍衍,等.2细辛醚对痴呆小鼠皮质神经元细胞内钙离子浓度的影响.中国康复医学杂志,2007,22(6:490491.8焦俊英,贾成文,赵卫锋,等.醒脑增智方对AD鼠G SH2PX、S OD、M DA影响的实验研究.陕西中医,2006,27(4:4974981 9马玉奎,李莉,刘国宾.知母皂苷对三氯化铝致老年性痴呆模型大鼠的作用.齐鲁药事,2005,24(10:6251经外科学分册,2000,7(3:153156.11沈玉先,杨军,魏伟,等.2淀粉样多肽2535片段诱导的大鼠学习记忆功能障碍.中国药理学通报,2001,1

21、7(1:2629.12臧艳平,马涤辉.2七叶皂甙钠对老年性痴呆大鼠模型脑内炎症损伤的保护作用.中国神经免疫学和神经病学杂志,2007,14(4:194196113殷越,冯涛.地黄饮子对D2半乳糖所致脑衰老小鼠学习记忆行为的影响.中医药学报,2002,30(6:5556.医学院学报,2000,22(1:19115赵淑梅,左凤英.呆聪液对老龄大鼠痴呆模型免疫功能的影响.淮坊医学院学报,2000,22(1:1112116黄兆胜,刘明平,万幸,等.养寿丹改善学习记忆作用的实验研究.中国老年学杂志,1998,18(2:9899117李斌,郭德玉,李林.三种老年痴呆动物模型行为学比较.中国实验动物学报,1

22、999,7(1:38118胡镜清.补肾益智方对老年性痴呆大鼠学习记忆能力保持作用的观察.广州中医药大学学报,2000,17(2:106109. 19邱幸凡,王平,袁德培.醒脑益智方对大鼠胆碱能系统的影响.中医药学刊,2006,24(8:1399120陆珊,雷亚平,王蓬文,等.APP5肽类似物165对老年性痴呆模型大鼠行为学及PS D95和Shank1表达的影响.中国神经免疫学和神经病学杂志,2007,14(4:183184.21胡镜清,赖世隆,王奇,等.D2半乳糖加速衰老合并M eynert核损毁大鼠学习记忆能力变化的初步观察.中华老年医学杂志,2000,19(2:133134122饶燕,高洁

23、,赖世隆,等.D2半乳糖合并M eynert基底核损毁对海马长时程增强和突触形态的影响.中国应用生理学杂志,2002,18(1:18201(下转第57页84实验动物科学26卷加强对学生的安全教育,由于静脉注射需要良好的犬只固定,为避免犬只咬伤,我们要求每组固定3名同学进行麻醉,麻醉时3名同学分工明确,经过第一周的锻炼,逐步使麻醉过程程序化4,后续3周同学们基本可以独立完成麻醉,教师在场进行指导。指导同学学会观察犬只在麻醉诱导中的反应,当犬只出现半闭眼、打呵欠、四肢肌张力下降等反应时,应进一步降低注药速度,必要时可以暂停给药,留置针头进行观察,若犬只结膜反射逐步消失时应停止给药进行束嘴、固定、脱

24、毛等处理,少数犬只由于个体差异,可能需要少量追加药物,但从本组大量犬只的麻醉效果看,药物总量均应控制在25mgkg 以内。通过对本组实验动物犬的麻醉效果观察,我们认为215%的戊巴比妥钠静脉注射麻醉安全、快捷,尤其适用于学生数量庞大、麻醉犬只需求量大的动物外科教学。参考文献学杂志,2004,10(1:4142.社,1994.28.4赵善超,孙大成,杜跃军,等.抓好现场管理,确保教学安全2手术学教学16年无实验动物伤人的报告.卫生职业教育,2006,24(13:101102.Anesthetic E ffect and Its I nfluencing F actors of Pentobarb

25、ital Sodium on DogsPAN Jun1,QI S ong2tao1,CHE N Qing2,S UN Da2cheng2(11Department o f Neuro surgery,NanFang Ho spital,Southren Medical Univer sity,Guangzhou510515,China(21Surgical Department,The Fir st Clinical Medical College,Southren Medical Univer sity,Guangzhou510515,ChinaAbstract:ObjectiveT o d

26、iscuss the anesthetic effect and its influencing factors of pentobarbitol s odium on dogs. Methods540dogs were anesthetized by215%and3%pentobarbital s odium intravenously in different week,the anesthetic effect and the acting time were recorded.R esultsAnesthetic effect were divided into g ood,m oderate,bad, and death according to the reaction of dogs,which occurred in418(7714%,55(10>2%,47(817%,and20 (317%respectivel