骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展

1、作者单位:第四军医大学口腔医学院颌面外科,西安(710032作者简介:刘彦普(1956-,河北人,副主任医师.骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展RESEARCH PR OGRESS ON BONE MARR OW MATRIC CE LL IN BONE TISSUE PR OJECT刘彦普,钱奇春,杨维东中图分类号:R322.7文献标识码:A 文章编号:100524979(20020320229204种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应具备以下特点:取材容易,损伤小;易定向分化为成骨细胞,传代繁殖力强;适应性强,植入机体后能保持成骨活性。目前,作为骨组织工程的种子细胞有4

2、种来源:骨、骨外膜、骨髓、骨外组织。这些来源各有优缺点,其中骨髓来源的骨髓基质细胞(b one m arrow strom al cell ,BMSC 具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化力强、易于接种成活等优点,在骨组织工程中显示出良好的应用前景。1BMSC 的成骨潜能骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织,由基质细胞和细胞间基质构成。骨髓成骨能力主要来源于BMSC 中的成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblast ,CFU 2F ,它具有多向分化潜能,在特定培养条件下可转化成多种间充质细胞,如成纤维系细胞、成骨系细胞

3、、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等1。Mani 2atopoulos 2等首次观察到鼠BMSC 在体外培养条件下具有形成钙化的骨样组织的能力,X 线衍射分析表明钙化物具有与骨组织类似的羟基磷灰石结构,免疫组织化学显示BMSC 产生I 型胶原,骨钙素(osteocalcin ,OC 与骨涎蛋白表达阴性。Benayahu 3等将BMSC 体外培养获得具有成骨细胞特性的细胞:具较高碱性磷酸酶(Alkaline ph osphatase ,A LP 活性、只产生I 型胶原、在条件培养液中可以产生矿化的胞外基质,移入微孔滤膜扩散室(millipore diffusion chamber ,M D

4、C 植入体内可培养成骨。BMSC 的分化可能是非定向性的,因为已分化基质细胞仍具有转化成其它类型基质细胞的潜能4。因此在一定诱导条件下,可使其向成骨细胞分化的数目大大增加,表明BMSC 具有很强的成骨潜能5。2BMSC 的来源与获取BMSC 可来源于机体各部位骨髓,人的BMSC 通常取自髂骨,不同来源的BMSC 的功能状态不一。此外,分离的BMSC 功能状态还受到取材部位和织体年龄的影响。M ilne 2M 6等发现,椎骨来源BMSC 的A LP 活性低于股骨来源的BMSC ,而OCmRNA 的水平较后者高。D Avis 2PY 7等观察到,随年龄增长,BMSC 的成骨活性呈下降趋势,认为这是

5、由于骨祖细胞的数目减少和/或对生长因子的反应性降低而致。BMSC 的获取,一般采用髓腔冲洗或者穿刺抽吸的方法。抽吸法损伤小,但每一部位每次骨髓的抽出量不应超过2ml ,否则将因吸出物中血量增加而引起有核细胞数的明显下降8。S olchaga 9等,分析了241份4月龄兔BM 2SC 获取物,发现所获得的BMSC 具有很大的变异性,其中A LP 活性变异系数高达132,因此强调制备过程的一致性,认为只有样本足够大,才能得到明确的结论。D obs on 10等提出离心分离方法,离心法所获得的CFU 2F 是冲洗法的二倍,并且具有简易、快速、变异小、可同时制备多份样品的优点。3BMSC 的诱导分化近

6、年来许多学者致力于探讨诱导BMSC 向成骨细胞分化的因素,并取得了一些进展。其中骨形成蛋白(bone m orphogenetic protein ,BMP 、转化生长因子(trans forming growth factor 2,TG F 2、地塞米松(dexamethas one ,Dex 、1,25羟基维生素D 3(1,25(OH 2D 3是目前研究较多的因子。3.1BMPBMP 是一类能在非骨骼部位诱导骨组织形成的特异性骨生长因子,能够诱导BMSC 定向分化为成骨细胞。Richard 等11研究表明,BMP 22能够快速诱导BMSC向成骨细胞转化,BMP22作用8天后, A LP活性

7、明显增强,A LP、OC、骨挢素、骨涎素的mR2 NA表达水平提高,并发现BMP联合Dex的骨诱导活性明显高于单独使用BMP22,认为在骨诱导过程中可能需要激素的参与。Akira等12证实,基因重组人骨形成蛋白22(rhBMP22对多能BMSC系ROBC26,同时具有促进分化和增殖的作用,而对分化较高的成骨细胞系ROB2C20则促进分化而抑制增殖,认为BMP的效应因细胞的不同分化程度而异。K im等13,认为BMP能促进前体成骨细胞向成骨细胞转化,但不能使其向成熟的成骨细胞转化。3.2TG F2TG F2是一族具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成的生长因子。Locklin等14发

8、现, TG F2能够抑制BMSC的增殖,但能促进A LP的表达,并能抑制BMSC向脂肪细胞的转化,显示TG F2具有促成骨分化能力。Andrades等15研究表明,基因重组人转化生长因子(rhTG F2有利于小鼠BMSC中骨髓基质成骨细胞克隆形成,能降低细胞增殖水平,但A LP表达水平和有钙化能力的克隆形成增加,表明rhTG F2可以诱导BMSC向成骨细胞分化和成熟。3.3地塞米松(DexM aniaeopoulos等2发现体外培养的BMSC中,加入地塞米松才能形成矿化结节,且矿化结节形成的时间、形状、数目与Dex加入的时间和剂量是一定依赖性。Y am aguchi等16发现,Dex在促进BM

9、SC向成骨细胞分化的同时,能够激活BMSC表面糖皮质激素受体,使其向脂肪细胞分化,从而减少向确定性骨祖细胞分化的比例。Cheng17等表明,Dex能抑制BMSC增殖,而促进其向成骨细胞分化。同时发现,加入Dex,胰导素样生长因子(insulin like growth factor IG F、及其结合蛋白的表达水平发生变化,认为,Dex对BMSC的作用可能是通过IG F介导而实现的。3.41,25(OH2D3K elly等18发现,1,25(OH2D3在促进BMSC成骨细胞分化的同时,能够降低脂肪细胞基因标志物ap2和adisin的mRNA水平,从而抑制由糖皮质激素诱导的脂肪细胞分化。Fauc

10、heux等19研究表明,1, 25(OH2D3促进BMSC中OC水平升高,同时刺激BMP23mRNA的表达,这种刺激在原代培养的H BM2 SC较已分化H BMSC更强,认为BMP23启动子可能同OC基因相似,呈现维生素D受体反应。生物力学因素在骨形成过程中可以影响细胞的生长、增殖和分化过程。Y oshikawa等20特制培养器培养BM2 SC,此培养可以对细胞产生周期性张力和拉力,同静态培养相比,外力作用下培养细胞的A LP活性、OC水平、DNA含量、细胞干重均明显升高。4BMSC的成骨作用随着三维多孔立体结构的生物降解支架材料的研制开发,BMSC与这此材料复合形成的生物活性植骨材料展示了广

11、阔的应用前景。Y oshikawa21,22等将经Dex诱导的BMSC与羟基磷灰石复合后植入同基因鼠皮下,并同自体松质骨的成骨能力进行比较,植入1周,即可观察到成骨形象,A LP和OC水平达到松质骨的64%和61%,2周后则分制达到111%和92%,甚至术后20周,仍有广泛骨形成能力。而未经Dex诱导的BMSC和新鲜骨髓者植入后A LP和OC水平都很低,且成骨时间较晚。表明新鲜骨髓与生物材料复合成骨效率不高。原因在于BMSC的多向分化性,植入后难以控制其成骨细胞分化,而经Dex诱导的BMSC植入后仍保持很高成骨活性。说明,体外适宜条件下使BMSC转化扩增,可以大大提高成骨效率,即能够利用少量骨

12、髓,在短期内得到大量的生物活性植骨材料。Casabona 等23设计了一种“预制工程化骨肌瓣”,将培养的BMSC与羟基磷灰石复合后植入裸鼠预制的带血管蒂的背阔肌瓣中,术后8周显示肌瓣中有广泛骨组织形成,血运丰富,细胞和基质材料复合体与肌瓣间界面良好,形成具有软组织覆盖的血管化的骨替代物,即工程化的带血管蒂的骨肌瓣。这使组织工程化骨组织完成代替自体骨移植成为可能。5基因工程化骨髓基质细胞基因工程的发展使人类可以通过改变基因的方式有目的的地改变细胞的性状和功能,利用基因工程将各种生长因子基因转入细胞,使细胞在增殖分化的同时表达所需生长因子,继而通过自分泌或旁分泌途径进一步促进细胞的增殖和分化,是较

13、理想的生长因子释放系统。Lieberman等24通过腺病毒将BMP22基因导入培养的鼠BMSC中,1周后即有效表达,将此细胞与脱矿骨基质复合修复同基因鼠股骨节段性缺损,以脱矿骨复合BMP22和脱矿骨复合未转染BMSC组为对照。植入2个月后发现,实验组缺损由粗大的骨小梁充填,呈含有骨髓的正常骨结构,而BMP22复合物组缺损由薄的编织骨充填,未转染BMSC组骨形成少,组织形态学定量分析显示:实验组骨形成总面积明显优于对照组。转基因方法的关键在于如何有效地调控转入基因,使之适时、适量表达,同时避免不良结果(如过度增殖的发生。6存在问题及前景至今,BMSC在骨组织工程中的应用研究主要停留在实验室及动物

14、实验阶段,需进一步深入研究,主要包括:发挥多种因子的协同作用和环境因素的影响,包括生物反应器的利用,使BMSC快速、大量向成骨细胞转化、扩增、建立标准化、产业化的培养系统,建立合适的细胞基质材料新生骨组织的效关系;运用基因工程的方法,通过改变BMSC的基因型调控细胞的增殖、分化过程,无疑是研究的又一方向。参考文献:1Beres ford JN,Bennett J H,Dvlin C,et al.Evidence for aniverse relationship between the differentiation of adipocyticand osteogenic cell in ra

15、t marrow stormal cell cultureJ.JCell Sci,1992,102(2:341.2Maniatopoulos C,S odek J,Melcher AH.Bone formation invitro by stromal cell obtained from b one marrow of y oung ad2lut ratJ.Cell T issue Res,1988,254(3:317.3Benayahu D,K letter Y,Z ipori D,et al.Bone marrow de2rived stromal cell line expressin

16、g osteoblastic phenotype invitro and osteogenic capacity in viv oJ.J Cell Sci,1989,140(1:1.4Park SR,Oreffo RO,T riffitt J T.Interconversion potential ofcoloned human marrow adipy ocytes in vitroJ.Bone,1999,24(6:549.5C onn olly JF.Injectable b one marrow preparation to stimulateosteogenic repairJ.C l

17、in Orth op,1995,313(4:8.6Milne M,Quail JM,Baran DT.Dexamethas one stimulatesosteogenic differentiation in vertibral and fem oral bone mar2row cell culture:com paris on of IG F2I gene expressionJ.Jcell Biochem,1998,71(3:382.7DAvis PY,Frazier CR,Shapiro JR,et al.Age relatedchanges in effects of insuli

18、m like growth factor on human os2teoblest like cellsJ.Biochem J,1997,324(3:753. 8Mudchler G F,Boehm C,Easley K,et al.Aspiration to ob2tain osteoblast progenitor cells from human bone marrow:thein fluence of aspiration v olumeJ.J Bone Joint Sury Am,1997,79(11:1699.9S olchaga LA,Johnstone B,Y oo Ju,et

19、 al.High variability inrabbit bone marrow derived mesenchymal cell preparationsJ.Cell T ransplant,1999,8(5:511.10D obs on K R,Reading L,Haberey M,et al.Centrifugal is o2lation of bone marrow from bone:an im proved method forthe recovery and quantitation of bone marrow osteoprogenitorcells from rat t

20、ibiae and femuraeJ.Calcif2T issue2Int,1999,65(5:411.11Rickard D J,Sullivan T A,Shenker B J,et al.Induction ofrapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromalcell culture by dexamethas one and BMP22J.Dev Biol,1994,161(1:218.12Akira Y,T akenobu K T ohru I,et al.Recombinant hu2man bone m orp

21、hogenetic protein22stimulate osteolbasticmaturation and inhibits my ogenic differentiation in vitroJ.J Cell Biol,1996,113(2:681.13K im K T,Itoh T,K otabe S,et al.E ffects of recombinanthuman bone m orphogenetic protein22on human bone marrowcells culture with varions biomaterialJ.J Biomed MaterRes,19

22、97,35(3:279.14Locklin R M,W illiams on M C,Beres fird JN,et al.In vitro e f2fects of grow th factors and dexamethes one on rat marrow stromalcellsJ.C lin Orth op,1995,313(4:27.15Andrades JA,Han B,Becerra J,et al.A reconabinant hu2man TG F2betal fusion protein with collagen2binding domainprom otes mi

23、gration growth and differentiation of bone marrowmesenchymal cellsJ.Exp Cell Res,1999,250(2:485.16Y amaguchi T,Chattopadhyay N,K ifor O,et al.Extracel2lular calcium(Ca2+(o2sensing receptor in a murine bonemarrow2derived stromal cell line(ST2:potential mediatorof the action of ca2+(oon the function o

24、f ST2cellsJ.Endocrinology,1998,139(8:3561.17Cheng S L,Zhang SF,M ohan S,et al.Regulation of in2sulin2like growth factorsandand their binding pro2teins in human bone marrow stromal cell by dexamethas oneJ.J Cell Biochem,1998,71(3:449.18K elly K A,G imble JM.1,252Dihydroxy vitamin D Inhibitsadipocyte

25、differentiation and gene expression in murine bonemarrow stromal cell clones and primary culturesJ.En2docrinology,1998,139(5:2622.19Faucheux C,Bareille R,Amedee J,et al.E ffect of1,25(OH2D3on b one m orph ogenetic protein23mRNAex pres2sionJ.J Cell Biochem,1999,73(1:11.20Y oshikaw T,Peel S A.G ladsto

26、ne JR,et al.Biochem ical anal2ysis of the res ponse in rat b one marrow cell culture to mechani2cal stimulationJ.Biomed M ater Eng,1997,7:369. 21Y oshikawa T,Ohgushi H,Akahane M,et al.Analysis ofgene expression in osteogenic cultured marrow/hydroxyap2atite construct im planted at ectopic sites :A co

27、m paris on with the osteogenic ability of cancellous bone J .J Biomed Mater Res ,1998,41(4:568.22Y oshikawa T ,Ohgushi H ,T amai S.Im mediate b one form ingcapability of pre fabricated osteogenic hydroxyapatite J .J Biomed M ater Res ,1996,32:481.23Casabona F ,Martin I ,Muraglia A ,et al.Prefabricat

28、ed en 2gineered bone flap :an experimental m odel of tissue recon 2struction in plastic surgery J .Plast Reconser Surg ,1998,101(3:577.24Lieberman JR ,Daluiski A ,S tevens on S ,et al.The effectof regional gene therapy with bone m orphogenetic protein 22producing bone 2marrow cells on the repair of segmental fem oral defects in rat J .J Bone Joint Surg Am ,1999,81(7:905.本文校对:胡丽华收稿日期:2001-05-15经验交流作者单位:东莞市东华医院(523000作者简介:刘思灏,男,东莞市