转基因鱼的研究进展

1、第 14卷第 2期 大 连 水 产 学 院 学 报 Vol. 14No. 2 1999年 6月 JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSIT Y Jun . 1999 综述文章编号 :1000-9957(1999 02-0054-08转基因鱼的研究进展谭海东 1, 张 波 1, 朱春阳 1, 郝景泉 2(1. 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 , 大连 116023; 2. 辽宁省铁岭市农业局 , 铁岭 112000摘要 :转基因鱼的外源基因构建需要有启 动子、目的 基因和 终止子 等 , 常用外 源基因 的 导入 方法有显微注射、电穿孔等 , 并 介绍了 外源

2、基 因表达 模式及 常用的 标记 基因。转 基因鱼的研究比较落后 , 当务之急是从分子水平上分析鱼类的生理现象及表达基因的结构。关键词 :转基因鱼 ; 启动子 ; 显微注射 ; 电穿孔中图分类号 :Q953 文献标识码 :A近几十年来 , 随着分子遗传学的迅速发展 , 许多生物转基因成为现实。从 1980年 以后 , 转基因研究已用于各种动物。尤其在 1982年 , Palm iter 1报道了给小鼠受精卵的 雄性原核导入大鼠的生长激素基因 , 获得了快速生长的 超级小鼠 , 比平常的小鼠大 一倍 , 引起了人们的极大兴趣。在鱼种改良上 , 转基因技术已用于各方面的研究。在基础领域内 , 被应

3、用于遗传基 因的整合、反式作用因子的机能分析及导入外源基因产生的蛋白质引起的生理机能分析 等 2。如反式作用因子的组织特异性和时期特异性 , 用培养细胞的方法进行分析比较 困难 , 但用转基因方法分析就容易。像澳大利亚斑马鱼可靠调节环境因素 , 在全年内都 可以得到受精卵。用鱼卵来进行外源基因的导入实验 , 比较适合分析初期发生的外源基 因表达。另外 , 转基因技术也被应用于鱼类育种上 3。以往为了向鱼类导入和固定有用的 外源基因 , 一直采用杂交技术 , 但这种技术用来固定目的基因需要的时间长 , 而且时常 发生有害基因的积累 , 给表现型带来不良影响 ; 还有杂交亲本具有不亲和性 , 其遗

4、传特 征难以预测。与此相比 , 在目的基因的蛋白质被确定的情况下 , 如果把目的基因单个分 离 , 改变后转入个体中去 , 就可能使其遗传特征在短期内转给个体或表达增强。为了进 一步使外源基因传给下一代 , 通过把这些个体有计划的进行交配的方法 , 可在短期内确 定具有目的基因的体系。如上所述 , 导入外源基因不管是在基础研究上还是在水产育种上 , 都有许多优点。 为此 , 作者就转基因鱼类外源基因的构建、导入及表达进行介绍。收稿日期 :1998 01 27作者简介 :谭海东 (1971 , 男 , 助理研究员。1 外源基因的构建外源基因的构建至少需要三个部分 :启动子、目的基因和终止子。启动

5、子是 DNA 分子上结合 RNA 聚合酶并形成转录起始复合物的区域 , 它和增强子 (增强转录活性的 结构 一起构成基因转录的顺势结构。终止子是使转录终止的序列 , 它构成基因转录的 主要反式因子 , 保证翻译到适当位置停止 , 以免出现过长的蛋白质。顺势作用因子和反 式作用因子协同调节基因转录的精确性、灵活性 , 特别是在细胞生长、发育、分化过程 中起重要的调控作用。目前还没有对鱼类基因顺反因子进行详细分析的例子 , 仅限于对 鲤鱼的 -肌动蛋白 4、鲑鱼的金属硫蛋白 5、美洲大绵 鱼 尉 及寒带比目鱼的抗冻蛋白 6等少数基因的研究。因此 , 至今转基因鱼所采用的启动子和增强子中很多是来自高

6、等动 物或以高等动物为宿主的病毒的启动子和增强子。生长激素基因和抗冻蛋白基因是当前 目的基因研究的热点。终止子的研究至今未见报道。1 1 启动子和增强子1 1 1 来自病毒基因的启动子和增强子在基因导入鱼类中 , 采用最广泛的还是来自高等动物病毒的启动子和增强子 , 以鱼 类细胞为宿主的病毒启动子和增强子的分析工作几乎没有进行 , 因此挪用高等动物细胞 内病毒的启动子和增强子。如 SV 40(猴病毒 40 是感染猿猴的一种病毒 , 这种病毒的 启动子和增强子在哺乳动物中的应用非常广泛 7, 已在鲤鱼的上皮细胞 8、鲑鱼的肝 细胞 9中发现活性。现正向各种鱼类导入 , 但仅能确认有低水平的表达。

7、 RSV 是感染 鸡的一种劳氏肉瘤病毒 , 在高等动物细胞内其启动子和增强子活性很高 , 特别是 LT R (长末端重复序列 表达非常强的活性 10, 是在鱼类 (如金鱼、斑马鱼、鲑鱼等 中使 用最广泛的启动子和增强子。腺病毒是感染新生儿的一种疱疹病毒 , 在斑马鱼细胞内这 种病毒的启动子和增强子有活性 , 在初期胚培养中推算出其活性是 RSVLTR (劳氏肉 瘤病毒长末端重复序列 近 2倍。 SV 40的启动子和增强子与一种病毒的 LTR 组合的启 动子和增强子在鲑鱼的初期胚中也显示出 RSVLTR 的 2倍活性 11。1 1 2 来自鱼类基因的启动子和增强子就期望目的基因有较高水平的表达或

8、表达组织特异性、时期特异性来说 , 一般用来 源于宿主细胞的启动子和增强子是最合适 , 即对于转基因鱼来源于鱼类的启动子和增强 子是最合适的。抗冻蛋白是南极海冰点下栖息鱼类具有的蛋白质 , 可防止冰点下体液冻 结 12。抗冻蛋白是在肝脏中产生的 , 在其它鱼类 (即原先不含抗冻蛋白的鱼类 上也 被断定有活性。来源于美洲大绵 鱼 尉 、寒带比目鱼的抗冻蛋白的启动子和增强子的活性 也是通过导入其它鱼中被发现的。将寒带比目鱼的抗冻蛋白基因的启动子和增强子导入 大西洋鲑中 , 抗冻蛋白在大西洋鲑的肝脏中有很强的表达 , 但这种抗冻蛋白的启动子和 增强子在斑马鱼初期胚的研究中其活性不如 RSV 的 LT

9、R 及后文要提到的肽链延伸因 子 3, 这和抗冻蛋白在肝脏组织特异性表达有关。金属硫蛋白是在肝脏中产生的能结合金属的蛋白质 , 对重金属有解毒作用。由于这 , 55第 2期 谭海东等 :转基因鱼的研究进展表达。在鲑鱼中分离出 2种金属硫蛋白基因 , 对其启动子和增强子的分析正在进行 5, 另外投入锌可以诱导外源基因在鱼胚中的表达 13。以上的抗冻蛋白和金属硫蛋白基因是在特定组织的特定条件下表达非常强的基因。 另外有些基因能在所有的组织中表达 , 这些基因被称为管家基因。如果把管家基因的启 动子和增强子与特定的基因结合导入鱼中 , 就能在所有的组织中表达。为达此目的 , 在 鱼类上采用了来源于肽

10、链延伸因子基因的启动子和增强子。 -肌动蛋白是构成细胞骨 架的蛋白质 , 来自鲤鱼的 -肌动蛋白基因的启动子和增强子已被详细分析 4。EF1 是一种合成蛋白质必需的肽链延伸因子 , 在真核细胞有较高的活性 14。大西 洋鲑的 EF1 在斑马鱼中显示较高的活性 , 其活性在下一代仍能被确定 15。1 1 3 来自高等动物的启动子和增强子前述的金属硫蛋白基因的启动子和增强子首先是在小鼠中发现的 , 后来用于金鱼、 泥鳅、鲑鱼、鲇鱼及大西洋鲑中 2, 但明确发现外源基因的例子很少。在鲑鱼、大西 洋鲑中报道了其活性 16, 但被染色体整合的状态尚未发现。来源于小鼠的热击蛋白的 启动子和增强子在斑马鱼的

11、初期胚上显示出非常高的活性。有人使用小鼠金属硫蛋白基因的启动子和增强子在虹鳟的肝脏细胞中表达目的基因 的强度只有使用其自身的金属硫蛋白基因的启动子和增强子的 1/2018。另外利用进行 转基因时 , 外源基因不应含有病毒的有潜在危害的 DNA 序列 , 因此 , 许多学者一致强 调构建 全鱼基因 的重要性和迫切性 19, 20。1 2 目的基因1 2 1 生长激素基因对鱼类目的基因的研究是从生长激素基因开始的 , 朱作言 21首先运用转基因技术 将人的生长激素基因的重组 DNA 导入鱼的受精卵中。随后在泥鳅 22, 23、阔尾 23、鲫 鱼 22, 24、缩骨鲫 25、青鱼 26、虹鳟 19,

12、 27、沟鲶 27、罗非鱼 28、鲑鱼 16, 29、鲂 等 生长激素的导入相继成功。Zhang 30通过 RSV 的 LTR 向鲤鱼导入虹鳟的生长激素互补 DNA, 生长速度比普 通鱼类快 20%, 而且这种特性可以遗传给下一代。美洲大绵 鱼 尉 抗冻蛋白基因的启动子 和增强子连接鲑鱼的生长激素互补 DNA 基因一起导入大西洋鲑 , 结果其生长速度比对 照组快 46倍 , 最高的可达 30倍 3, 而且这种大西洋鲑的下一代同样显出较高的生长 率。由于抗冻蛋白基因的启动子和增强子在肝脏中活性最高 , 所以有人开始考察在肝脏 中产生的生长激素是否与肝脏中存在生长激素的受体有关。近来在黑鲷的研究中

13、发现 , 生长激素不仅可以促进生长 , 还可以提高鱼苗的成活率 31。1 2 2 抗冻蛋白基因当海水温度低到冰点以下 , 很多鱼不能生存 , 而前面介绍的具有抗冻蛋白的鱼类却 能生存。如果把这种基因导入普通的鱼类 , 使它们在体内产生抗冻蛋白 , 这样即使在冰 点以下也可以养殖普通的鱼类。56大 连 水 产 学 院 学 报 第 14卷 , (2 外源基因的导入2 1 显微注射法 32外源基因的导入最常用的方法是给鱼卵进行显微注射 , 即把外源基因吸入玻璃细管 内在显微镜下注入鱼卵。斑马鱼、鲑鱼、大西洋鲑、鲤鱼、美国鲇鱼、泥鳅、金鱼、鲫 鱼等均被采用 。通常外源基因是在受精卵第一次卵裂前注入胚孔

14、中。可鱼类的卵膜非 常坚硬 , 微管难以通过。为克服这一点 , Chourrout 27用金属针打开孔后 , 再用玻璃微 管进行显微注射。由于鲤科鱼的卵膜易被蛋白质分解酶分解 , 有的研究人员除去卵膜后 再进行显微注射 33, 34。另外 , 鲑科鱼类的卵膜吸水后开始硬化 , 在大麻哈鱼上可采用 刚受精卵膜尚未硬化就进行显微注射的方法 19, 35。还有 , 一些鱼类的受精孔容易确定 , 通过开孔进行显微注射 28。近来 , Yoshizaki 36发现鲑鱼的卵在还原型谷胱甘肽溶液中受精能防止卵膜硬化 , 并找到了非常容易进行显微注射的方法。 Ozato 37把即将成熟的卵母细胞取出 (未受精

15、卵卵膜不硬化 , 向此卵母细胞进行注射。综上所述三种显微注 射法为 :一是从受精孔将 DNA 溶液注入卵中 , 简称 MP 法 ; 二是在受精卵刚受精后卵 壳尚未变硬时直接注射 , 简称 EI 法 ; 三是用金属针在卵壳上打一个孔 , 再进行显微注 射 , 简称 LI 法。2 2 电穿孔法所谓电穿孔法 , 是在细胞 DNA 的混合液中加入电脉冲 , 使细胞膜临时被破坏 , 这 样细胞外存在的 DNA 分子既可流入细胞内。这种方 法本来只用于细胞培养方面的技 术 , 可是用于混有精子、卵子的 DNA 溶液中 , 也可以得到导入外源基因的鱼。此法用 于斑马鱼 38, 39、美国大麻哈 鱼 38、鲤

16、鱼 38、泥鳅 40的受精卵及斑马鱼 41、大麻哈鱼 42, 43的精子 , 成功地把外源基因导入鱼内 , 该方法具有能轻易处理大量精子和卵子 的优点 , 但存在着外源基因导入率低于显微注射的问题。可有的报道 PCR 法 (聚合酶 链式反应 检测电脉冲法导入外源基因的大麻哈鱼是否存在外源基因时 , 结果全部个体 均被检出外源基因 38, 这个高导入率可能与 PCR 的经验灵敏度非常高有关。也就是 说 , 由于电脉冲法很难像显微注射法那样向细胞内导入同样多的外源基因 , 所以认为每 个细胞所含外源基因的拷贝数要比注射法所得到的拷贝数低一些。同样理由可以推测 , 电穿孔法得到的个体是含外源基因极低

17、的嵌合体。2 3 基因枪注射法基因枪注射法是通过把吸附 DNA 的金属微粒高速打入细胞内 , 使基因导入细胞内 的方法。有人在泥鳅、斑马鱼、鲑鱼的三日胚上应用此法 44, 结果 70%的个体生存 , 一部分个体导入了外源基因。此法不仅容易进行 , 而且有短期可处理多个个体的优点 , 只是现在的报道太少 , 有待今后研究。2 4 逆转录病毒感染法 57第 2期 谭海东等 :转基因鱼的研究进展细胞的染色体上 , 从这种纳入病毒基因组的细胞产生的细胞染色体内就存在了病毒基 因。如果把目的基因组合到病毒染色体上 , 用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞 内导入外源基因 45, 但转基因病毒有严格的宿

18、主特异性 , 而且鱼类转基因病毒的分析 非常落后 , 对于鱼类很难适应此法。有人用能广泛感染宿主的 VSV (水疱性口炎病毒 的 G-蛋白组合的病毒感染斑马鱼的胚 , 表明外源基因不仅可以导入鱼内 , 而且还有外 源基因导入时很少改变的优点 46。2 5 组织注射法有报道外源基因向体组织直接注射时 , 周围细胞把外源基因纳入 , 并且发现了那种 外源基因。有人把 CAT (链霉素转移酶基因 注射到一些鱼的体侧肌肉上 , 从肌肉匀 浆中检出 CAT 活性 47。另一方面 , 把含有合成黑色素的互补 DNA 质粒注射到一些鱼 的体侧肌肉上 , 使周围体表合成黑色素 , 体表黑化 47。这种方法能非

19、常容易地把外源 基因导入细胞内 , 所以对检出外源基因启动子非常有效。2 6 精子携带法最近 , 有人报道把脱水的精子悬浮于低浓度的 DNA 溶液中 , 在细胞外液流入最旺 时加入电脉冲 , 细胞外 DNA 向精子内流动效率提高 48。另外 , 精子与 DNA 共培养 , 使一部分精子获得外源基因 , 并且 DNA 与精子的结合效率较高 2, 但有必要探讨导入 率及重复性。3 外源基因的表达关于快速生长转基因鱼的表达、产生方法和机制 , 朱作言 49已做了详细的研究。 笔者只介绍一下外源基因的表达模式及标记基因。3 1 每个阶段外源基因的表达模式向鱼卵导入外源基因 , 被宿主染色体整合 , 同

20、时其表达模式在初期发育中也有很大 幅度的变化。向鲑鱼内导入 RSVCAT (劳氏肉瘤病毒氯霉素转移酶基因 , 囊胚期以前 的时期未能全部确认 , 可在囊胚期开始至发眼期为止 , 发现有高水平的表达 , 孵化期表 达量开始下降 50。抗冻蛋白基因的启动子和增强子活性在发眼期前后开始上升 , 而在 孵化期下降 7。 -肌动蛋白的启动子和增强子在受精后 35d 显示出高活性 , 其后急 剧减少 8。如上所述 , 由于所采用的启动子和增强子或宿主的不同 , 其表达模式有所 差异 , 但均在孵化期前后表达量减少。因此 , 可以推测在初期胚过程中暂时表达的基因 是未被染色体整合的外源基因 , 当外源基因被

21、分解排除后 , 表达量就急剧减少。但在鲑 鱼的每一个细胞 DNA 量非常少的 12d 胚中 , 在发眼期也有外源基因的高度表达 , 与此 时期 RSVLTR 活性化起作用有关。向鲑鱼内导入 RSVCAT , 受精后 70d 开始看到被染 色体结合的基因得到表达 , 从其个体得到下一代个体的一部分也表达了 RSVCAT 。在 鲤鱼中导入 RSV 的 LTR 生长激素互补 DNA 及在大麻哈鱼中导入抗冻蛋白基因 , 均在 , 在 58大 连 水 产 学 院 学 报 第 14卷第2期 谭海东等: 转基因鱼的研究进展 59 下一代中也显示出较高活性 15 。 被染色体整合的外源基因因结合位置的不同,

22、其表达受到很大影响, 这种现象被称 为位置效应。被整合的外源基因的表达受到附近基因的促进或抑制, 特别是导入的启动 子和增强子活性弱时, 其影响更显著。今后, 应重点开发被染色体整合的也能高水平正 确表达的启动子和增强子。 3 2 标记基因 如上所述, 采用各种鱼进行外源基因的表达研究, 从复制水平上分析, 通常采用探 针杂交技术; 在蛋白质水平上, 是用抗体和抗原特异结合的特性来进行分析。可是这些 方法测定时间长, 操作繁琐, 低水平表达的基因很难检出。于是在检测外源基因的表达 时多采用标记基因, 能高灵敏度检出转录、翻译产物的基因。由于所有的标记基因都是 编码酶的蛋白质, 所以把蛋白质加入

23、组织提取液或组织中就能检出其酶的活性, 随着酶 反应时间的延长来提高检验的灵敏度, 特别是在新启动子和增强子开放领域内, 本方法 是必不可少的技术。对转基因鱼来说, CAT 基因、 - 半乳糖苷酶基因以及荧光素酶基 因多被采用。无论采用那种酶都能高灵敏度地、简便地检出表达基因。乳糖苷酶在组织 切片上也能使表达组织着色, 而且在鱼类的胚原封不动的情况下也能检出其活性, 因而 这种方法最适合外源基因在每个组织中的表达分析。荧光素酶是促进组织提取液同荧光 素发生反应的酶。小林修一 51 把 GFP ( 绿色荧光蛋白基因 导入斑马鱼, 由于 GFP 受 紫外线照射, GFP 分子本身发出荧光, 所以非

24、常容易检出, 因此认为此法可用于活体 组织中启动子和增强子活性的检出。T amiya 52 通过转基因法把萤火虫的荧光素酶基因 导入鱼体内, 可以得到能发出荧光的鱼。 以上就转基因鱼的研究作了介绍, 这个领域正在高速发展, 特别是在基础生物学领 域。同时, 基因导入技术的应用也越来越广泛, 但不清楚的地方还很多, 当务之急是从 分子水平上分析鱼类的生理现象及表达基因的结构, 以便使人们更能自如地进行转基因 操作, 让转基因鱼从实验室走向生产化, 培育出具有生长快、抗病等特点的优良品种。 参 1 sion gene J . N at ure, 1992, 300( 16 : 611 615. 2

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