抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定

1、抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定    田长恩王正询陈韬周玉萍黄自然黄亚东 摘要：用花粉管通道法将柞蚕抗菌肽D基因导入番茄，获得了转基因植株。应用PCR技术、DNA斑点杂交以及Southern印迹分析表明，抗菌肽D基因已整合到番茄基因组；而且，位于目的基因下游的胭脂碱合成酶基因有表达。青枯假单孢菌活体接种结合高发病大田种植试验结果显示，部分转基因植株的子一代具有较强的抗青枯病能力。 关键词： 抗菌肽D基因； 花粉通道法； 番茄； 青枯病 中图分类号： Q78； S330文献标识码： A文章编号： 02539772(2000)02008604 Tra

2、nsfer of Antibacterial Peptide D Gene into Tomato and Identification of Transgenic Plants TIAN Chang-enWANG Zheng-xunCHEN TaoZHOU Yu-ping （Department of Biology, Guangzhou Teacher's College, Guangzhou 510405） HANG Zi-ranHANG Ya-dong （Department of Sericulture, South China Agricultural University

3、, Guangzhou 510642，China） Abstract:By using pollen-tube pathway,antibacterial peptide D(AP-D) gene developed from Chinese oak silkwarm was transferred into tomato.PCR,dot and Southern blot analysis confirmed that stable integration of AP-D gene into the tomato genome had occurred.The expression of N

4、OP gene which was localized at downstream of AP-D gene was confirmed with nopaline detection.In comparision with non-transgenicplants,some transgenic plant expressed a stronger resistance value to bacterialwilt disease (Pseudomonas solanacearum). Key words: antibacterial peptide-D gene; pollen-tube

5、pathway; tomato; bacterialwilt 70年代中期，人们发现天蚕在各种理化或生物因子刺激下，在其血淋巴中可诱导产生抗菌肽（cecropins）等物质。抗菌肽具有极强的杀菌或抑菌能力，且其杀、抑菌谱广泛，对诸如绿脓杆菌、大肠杆菌和金色葡萄球菌等人畜病原菌1，以及烟草2、马铃薯3青枯病和水稻白叶枯病4等植物病原菌均有杀、抑作用。抗菌肽D由36个氨基酸组成，其结构已有较为详尽的研究5。徐飞等根据抗菌肽的氨基酸组成结构人工合成了抗菌肽D(AP-D:antibacterial peptide-D)基因6，共122bp。因此，将抗菌肽基因导入植物，探索增强作物抗细菌病能力已完全可行

6、。 番茄是一种世界性蔬菜，具有很高的经济价值。但其病害多，其中尤以青枯病等细菌病的危害广而重7,8。业已发现，将抗菌肽基因导入烟草2、马铃薯3和广藿香9皆可增强这些作物对青枯病的抗性。因此，若将抗菌肽基因导入番茄，可为番茄抗青枯病育种提供新的种质资源。花粉管通道法是一种简单实用的外源基因导入法，已在棉花10,11、水稻12和玉米13等作物的遗传转化中得到成功应用。本文报道了此法在番茄遗传转化中的应用以及转基因植株的分子检测和抗青枯病的初步鉴定结果。 1材料与方法 11材料 111转化用重组质粒由华南农业大学蚕桑系黄自然教授提供，将抗菌肽D基因(AP-D gene)置于CaMV 35S下游，其两

7、端有EcoRI的酶切位点，抗菌肽D基因的下游是胭脂碱合成酶基因(NOP)。其结构见图1： 图1重组质粒Co24结构 1.CaMV 35S;2.AP-D gene clone site;3.NOP; 4.Spc/Str;5.AP-D gene。 112植物材料供试番茄（Lycopersion esculetum)品种为G7，种子由广州市蔬菜科学研究所提供，常规方法种植和管理。 113生化试剂地高辛（DIG：digoxigenin）DNA标记与检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit)为Boehringer Mannheim Co.产品，dNTP和Taq酶购

8、自华美生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯或优级纯。 12方法 121外源基因导入采用花粉管通道法。在番茄开花授粉2428h内剪去柱头，滴注载有抗菌肽D基因的重组质粒溶液(浓度为：01g/L)。标记好滴注过的花，结果成熟后收集种子。 122胭脂碱检测参照Otten等及许耀等的方法略为改进14,15。取幼嫩叶片于含有精氨酸及营养物质的固体培养基上培养24小时，用无水乙醇抽提胭脂碱，点样于滤纸，在甲酸乙酸水（121563）电泳60 min，风干后用菲醌染色，再风干，紫外灯下对照标样观察。 123转化植株DNA的提取参照孙敬三16的SDS法略加改进。在将DNA沉淀溶于TE溶液后，用酚氯仿异戊醇（25

9、241）抽提一次， 再用氯仿异戊醇（241）抽提一次，然后用乙醇沉淀DNA，收集DNA溶于TE溶液，保存于20备用。 124PCR扩增程序与条件模板DNA：转化植株与非转化植株总DNA；引物I（）：5GCTCGAGTGGAATCCATTCAAGGAATTG 3；引物II()：5CGAATTCTTAACCCTTGGCCAAGGCAGTAGCTTG 3。反应总体积为20l。在95变性5min后，按93 1min、55 1min、72 1min 进行40个循环反应。以未转化植株为阴性对照，以转化用重组质粒为阳性对照。 125DNA斑点杂交将转化和未转化植株以及重组质粒的纯化DNA点在尼龙膜上，经预杂

10、交后，加入DIG标记的抗菌肽D基因探针，按Sambrook等17的方法进行杂交和洗膜。探针制备:用转化质粒作模板，加入上述PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP(含DIG-dUTP)等，并按上述程序进行扩增。扩增结束后，按DIG KIT说明书进行DIG标记DNA产量检测。显色：按DIG DNA Labeling and Detection Kit（Boehringer Mannheim Co产品）说明书进行。对照同PCR扩增。 126Southern杂交先将经限制内切酶EcoRI消化过的植株总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，后经HCl处理和碱变性，再按Sambrook等17的方法进行转膜、预杂交

11、、杂交、洗膜和显色。探针的制备和DIG显色同DNA斑点杂交。对照同PCR扩增。 127转基因番茄抗青枯病的鉴定先将欲移栽的转基因番茄及未转基因的G7之子一代幼苗（各50株）进行青枯假单孢菌（Pseudomonas solanace- arum Smith.;菌种由广州蔬菜研究所提供）浸根处理（菌液浓度为：1×108 cfu/ml）,然后，将处理过的幼苗种植在高发病的大田，观察记录植株的发病情况。      2结果与分析 21花粉管介导的番茄遗传转化 通过花粉管通道法，用带有抗菌肽D基因的重组Co24质粒处理番茄花226朵，得到成熟番茄62个,约

12、1 000籽，种子发芽成苗后得成活苗840株。取其幼叶进行胭脂碱检测，共筛选出10个阳性植株。其转化率为12。 22PCR技术检测抗菌肽D基因 以未转化植株基因组DNA为阴性对照，以转化用重组质粒DNA为阳性对照，以抗菌肽D基因的引物对胭脂碱检测阳性的植株进行PCR分析，结果见图2。由图2可知，阴性对照未出现扩增条带，阳性对照出现一条分子量约为122bp的条带，与预期的抗菌肽D基因的扩增带大小一致。在胭脂碱检测阳性植株中，除一株外其余均为阳性。PCR结果表明，目的基因已进入番茄细胞中。 图2假定转化株基因组抗菌肽D基因的PCR分析 1.Marker；2.阳性对照；4.阴性对照；3、5、6、7、

13、8.假定转化植株。 23DNA斑点杂交 对胭脂碱检测阳性的植株进行DNA斑点杂交分析,其结果与PCR分析一致（图3）。 图3假定转化株抗菌肽D基因的斑点杂交分析 1.阳性对照；2.阴性对照；3、4、5、6、7、8.假定转化株。 24Southern印迹分析 对胭脂碱检测阳性的植株进行Southern杂交，其结果与DNA斑点杂交的一致(图4)。说明抗菌肽D基因已整合到番茄基因组。杂交图上多数样品在156bp处有杂交带，6号样品有大于156bp的分子条带，说明这个样品转入基因在番茄基因组的整合方式与其他样品不同，且可能整合后改变了EcoRI的酶切位点。 图4部分假定转化株抗菌肽D基因的Southe

14、rn印迹分析 1.阳性对照；2.阴性对照；3、4、5、6、7.假定转化株。 25转基因番茄抗青枯病的初步鉴定 将分子检测证实已转入了抗菌肽D基因的番茄之子一代幼苗进行青枯假单孢菌浸根，然后种植在青枯病高发病的大田，观察结果如下：不管是否转入抗菌肽D基因，开花前各种植株青枯病发病率低，且各处理间无明显差异；开花后，发病率提高。在所试植株中，代号为C31的转基因番茄子一代青枯病发病率明显较原始品种低（表1、图5）。 图5转基因番茄抗青枯病试验 C31.转基因植株子一代；CK.原始品种。 表1转抗菌肽D基因植株子一代抗青枯病试验 材料 检验株数 花前死亡 花后死亡 株数 % 株数 % 对照(G-7)

15、 50 3 6.0 29 58.0 转基因植株(C-31) 50 2 4.0 18 36.0 3讨论 番茄遗传转化多采用Horsch等18的叶圆盘转化法进行农杆菌导入，再进行转化体的筛选及植株再生。该法需经组织培养再生植株，费时费工。采用花粉管通道法进行基因转化，可省去组织培养等繁琐过程。在番茄上少见应用此法的报道，本研究丰富了番茄遗传转化的方法。在花粉管通道法操作中有三点必须注意：(1)选择好滴注时间。番茄授粉后花粉粒萌发和花粉管的伸长都较慢，到达胚囊的时间约为2024小时，完成受精则约需50小时，受精卵的分裂在94小时开始，且整个过程受温度和湿度的影响较大。本研究选择的滴注时间就是花粉管伸

16、到胚囊开始受精的理论时间，但这个时间并不好掌握。本实验种植材料地处广州，开花时间是10月，白天温度大约32左右，夜晚25左右。将滴注时间定在开花后约26小时，但有时气温高就错过了最好的滴注时间，使转化率下降。同时，气温过高也会降低受精率、座果率和每果籽粒数。(2)注意天气情况，一般在黄昏进行，下雨或烈日都会影响效果。(3)选好滴注对象，以主枝上的强势花为好。本实验所处理的花中弱势花多，加上早晨湿度大，花药开裂少，造成座果率低。本研究所得转化率相对较低，可能与滴注时间掌握不好有关。 本试验对通过花粉管通道法所获种子的幼苗进行了逐株胭脂碱检测，以阳性株为假定转化株。然后对假定转化植株进行了PCR分

17、析、DNA斑点杂交及Southern印迹分析，结果一致说明抗菌肽D基因已整合到番茄基因组中（图2，3），并有不同的整合方式（图4）。这为研究转入基因不同整合方式与表达的关系和获取多位点转基因植株提供了材料。胭脂碱合成酶基因位于抗菌肽D基因的下游，且和该基因共一个启动子（图1）。在转化植株中，都检测到了胭脂碱，说明转入的基因能表达。这与将同样基因转入烟草2 和辣椒(个人通信)能表达的结果一致。 如在前言中所述，抗菌肽对包括青枯病菌在内的许多细菌具有杀、抑作用。转入抗菌肽基因能提高烟草2、马铃薯3、广藿香9和辣椒(个人通信)等作物对青枯病以及水稻白叶枯病3,19的抗性。本研究之抗青枯病初步鉴定结果

18、显示，某些转基因番茄子一代具有较原始材料高的青枯病抗性。从而，有可能从这些转基因番茄中筛选出抗青枯病的新种质资源。目前，本课题组正在就转基因番茄子二代等的抗青枯病和抗其他细菌性病的能力以及转入基因的遗传方式作进一步研究。 基金项目：广州市重点项目（9620402）资助 作者简介：田长恩（1964），男，湖北恩施人，博士，副教授；专业方向：遗传学；EMail:tianchangen163net 王正询（1951），男，江西南昌人，博士，教授；专业方向：植物遗传学，通讯联系人。 田长恩（广州师范学院生物学系，广州 510405） 王正询（广州师范学院生物学系，广州 510405） 陈韬（广州师范学

19、院生物学系，广州 510405） 周玉萍（广州师范学院生物学系，广州 510405） 黄自然（华南农业大学蚕桑系, 广州 510642） 黄亚东（华南农业大学蚕桑系, 广州 510642） 参 考 文 献： 1黄自然，郑庭辉，梁怡章,等. 柞蚕抗菌肽的抑菌效应J.科学通报，1986,31（14）:11071109. 2黄自然，徐飞，庄楚雄,等. 农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入烟的研究J.华南农业大学学报，1992,13（4）：15. 3贾士荣，屈贤铭，冯兰香,等.抗菌肽基因提高马铃薯对青枯病的抗性J.中国农业科学,1998，31（3）：512. 4董 春，何汉古，王润华,等.柞蚕抗菌肽对水稻白叶

20、枯病菌的抑制作用J.华南农业大学学报，1992,13（4）：5862. 5Qu X M,Steiner H,Engstrom A,et al.Iimmunity: isolation and Structure of cecropins B and D from pupae of the Chinese oak silkwarm,Antheraea pernyiJ.Eur J Biochem,1982,127:219224 .      6徐 飞，施 文，王启东,等.柞蚕抗菌肽D基因的合成J.科学通报，1988，33（21）：16561659. 7华中农学院，东北农学院编.蔬菜病理学M.北京：农业出版社，1979,125175. 8斋藤隆著(北京农业大学译).蔬菜生理学基础M.北京：农业出版社，1985，99222. 9张家明，孙雪飘，郑学勤.抗菌肽B、D基因表达载体的构建及转化广藿香的研究J.热带作物学报，1997,18（1）：5057. 10谢道昕 ，范云六，倪万潮，等.苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株J.中国科学（B辑），1991,21：367373. 11 Zhou G Y. Intruduction of exogenous DNA into