正向间接血凝试验

1、正向间接血凝试验正向间接血凝试验省疫控中心周迎春主要内容主要内容l背景背景l原理原理l实验器材的优化实验器材的优化l试剂的优化试剂的优化l样品的优化样品的优化l实验过程优化实验过程优化l判定标准判定标准l注意问题注意问题一、背景一、背景l正向间接血凝试验正向间接血凝试验(IHA)是上世纪是上世纪 60 年代在我年代在我国发展起来的血清学诊断技术，是一种用已知国发展起来的血清学诊断技术，是一种用已知抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，

2、条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。具有现实意义。l林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法(IHA)与斑点酶联免疫吸附试验（与斑点酶联免疫吸附试验（dot- ELISA）以及）以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪场场 138份不同阶段猪血清进行检测，三种方法份不同阶段猪血清进行检测，三种方法检测抗体的阳性率结果接近。检测抗体的阳性率结果接近。一、背景一、背景l数十年来正向间接血凝试验技术不断完善，它数十年来正向间接血

3、凝试验技术不断完善，它具有简单、经济、快速、实用的特点，在我国具有简单、经济、快速、实用的特点，在我国有很大的用户群，近年来，兰州兽医研究所生有很大的用户群，近年来，兰州兽医研究所生产的液体猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试产的液体猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试剂用量在逐年加大。然而，正向间接血凝作为剂用量在逐年加大。然而，正向间接血凝作为一种微量的定量反应试验，实验结果受操作技一种微量的定量反应试验，实验结果受操作技术影响较大，任何操作环节的纰漏都会使最后术影响较大，任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭。判定的结果与正确结论大相径庭。l为规范操作，本次培训就实验中器材、试

4、剂、为规范操作，本次培训就实验中器材、试剂、样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述，样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述，以期作为此实验的借鉴。以期作为此实验的借鉴。 二、原理二、原理l正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。可见的凝集性反应。二、原理二、原理l充分理解正向间接血凝试验的原理，对整充分理解正向间接血凝试验的

5、原理，对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。导意义。 http:/ http:/ 或者一次性或者一次性的的110底角的底角的 96 孔孔 V 型微量血凝板。有机玻型微量血凝板。有机玻璃板板可以叠放，不占实验室台面，处理样品璃板板可以叠放，不占实验室台面，处理样品量较大时合适，但每次用完需要清洗。清洗方量较大时合适，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于37温箱中温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如烘干。用前要先检

6、查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但不能叠放，测定少量样品适合。不能叠放，测定少量样品适合。三、实验器材的优化三、实验器材的优化l2、 微量振荡器微量振荡器l使用振荡器振荡时间不宜超过使用振荡器振荡时间不宜超过 10 秒钟，秒钟，振荡强度不能太大，先从小到大，中等强振荡强度不能太大，先从小到大，中等强度即可。多块板叠加后振荡时要用手压住度即可。多块板叠加后振荡时要用

7、手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。如果实验溅出而影响实验结果的准确性。如果实验室没有它，也可用手轻拍血凝板的边缘即室没有它，也可用手轻拍血凝板的边缘即可。可。三、实验器材的优化三、实验器材的优化l3 、单、多道微量移液器、单、多道微量移液器l建议使用高质量的移液器，用定量移液器需要建议使用高质量的移液器，用定量移液器需要准备准备 50 微升和微升和 25 微升两种。微升两种。50 微升的用来微升的用来加稀释液和稀释血清，加稀释液和稀释血清，25 微升的用来加血凝抗微升的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量原

8、。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的移液器，吸取液体时动作要轻缓，相近量程的移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的习惯，移液器如果掉到地下很容易液器架上的习惯，移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用损坏。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并的酒精棉擦拭，并把刻度调到最大值。把刻度调到最大值。三、实验器材的优化三、实验器材的优化l4、 吸嘴吸嘴l高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理高质量的吸嘴经过处理后可以重复使

9、用。处理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器处理洗，用超声波清洗器处理10分钟，换水后用二分钟，换水后用二层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器处理器处理 10 分钟，再用洗衣机甩干，高压消毒灭分钟，再用洗衣机甩干，高压消毒灭菌器中菌器中 121，20分钟即可，去盖放分钟即可，去盖放 37温箱温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸

10、嘴如吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸嘴如果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。四、试剂的优化四、试剂的优化l1、 抗原抗原l液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色，无块状物液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用。块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用。如果只做筛检看是否达到合格线，一瓶抗原可如果只做筛检看是否达到合格线，一瓶抗原可以检测以检测 30 到到 50

11、 份血清。值得一提的是液体正份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原向血凝抗原 48保存，保存期保存，保存期3个月，不能冷个月，不能冷冻保存。冻保存。四、试剂的优化四、试剂的优化l2、对照血清、对照血清l阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照血清可在血清可在- 15到到 - 20保存，有效期保存，有效期 1 年。年。l3 、稀释液、稀释液l稀释液无色透明，一般情况稀释液无色透明，一般情况 48保存。用前保存。用前建议将稀释液放建议将稀释液放 室温或室温或37温箱中半小时后摇温箱

12、中半小时后摇匀再用较好。试剂不能放置太久，最好新进现匀再用较好。试剂不能放置太久，最好新进现用。用。五、样品血清的优化五、样品血清的优化l新分离血清尽快检测完，未检血清新分离血清尽快检测完，未检血清 - 20保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。不宜检测，以免发生非特异性反应。六、实验过程优化六、实验过程优化l正向血凝实验过程包括：加稀释液，稀释正向血凝实验过程包括：加稀释液，稀释待检血

13、清，稀释阴性、阳性血清，加血凝待检血清，稀释阴性、阳性血清，加血凝抗原，震荡静置，结果判定。在试验中要抗原，震荡静置，结果判定。在试验中要注意以下的问题：注意以下的问题：l1、加稀释液、加稀释液l在血凝板上在血凝板上16 排的排的 19 孔；第孔；第 7 排的排的 14孔，第孔，第6-7孔；第孔；第 8 排的排的 112 孔各加孔各加稀释液稀释液 50 微升。微升。六、实验过程优化六、实验过程优化l2、稀释待检血清、稀释待检血清l取取1号待检血清号待检血清 50 微升加入第微升加入第 1 排第排第 1 孔，并孔，并将枪头插入孔底，混匀后，从该孔吸取将枪头插入孔底，混匀后，从该孔吸取 50 微升

14、微升移入第移入第 2 孔，混匀后从该孔吸取孔，混匀后从该孔吸取 50 微升移入微升移入第第 3 孔直至第孔直至第 9 孔。此时第孔。此时第 1 排排 19 孔待检血孔待检血清的稀释度（稀释倍数）清的稀释度（稀释倍数） 依次为依次为 1 2、1 4、1 81 256、1 512。每个待检血清样品。每个待检血清样品均按上述方法稀释，每稀释一份血清要换吸嘴。均按上述方法稀释，每稀释一份血清要换吸嘴。每次滴加样本后应吸取稀释液并冲洗几次，最每次滴加样本后应吸取稀释液并冲洗几次，最后将滴头内的残液完全排尽，以尽可能的保证后将滴头内的残液完全排尽，以尽可能的保证样品被全部加入反应孔。作倍比稀释前，应且样品

15、被全部加入反应孔。作倍比稀释前，应且记将滴头内的空气排尽，避免稀释时孔内产生记将滴头内的空气排尽，避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。气泡，直接影响结果判定。六、实验过程优化六、实验过程优化l3、稀释阴性对照血清、稀释阴性对照血清l在血凝板上的第在血凝板上的第 7 排第排第 1 孔加阴性血清孔加阴性血清 50 微升，对倍稀释至第微升，对倍稀释至第4 孔。此时阴性孔。此时阴性血清的稀释倍数依次为血清的稀释倍数依次为 1 2、1 4、1 8、1 16。第。第 6-7孔为稀释液对照孔。孔为稀释液对照孔。六、实验过程优化六、实验过程优化l4、稀释阳性对照血清、稀释阳性对照血清l在血凝板上的第在血

16、凝板上的第 8 排第排第 1 孔加阳性血清孔加阳性血清 50 微升，对倍稀释至第微升，对倍稀释至第 12 孔。此时阳性孔。此时阳性血清的稀释倍数依次为血清的稀释倍数依次为 1 2、1 4、1 81 2048、1 4096。l每次试验要做阴阳性对照，最好也做二孔每次试验要做阴阳性对照，最好也做二孔空白对照，即孔中加空白对照，即孔中加 50 微升稀释液后加微升稀释液后加25 微升抗原。每次检测时阴性、阳性和微升抗原。每次检测时阴性、阳性和稀释液对照只需各做一份。稀释液对照只需各做一份。六、实验过程优化六、实验过程优化l5、加血凝抗原、加血凝抗原l被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照被检血清各孔、阴

17、性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分摇匀，瓶底应微升。血凝抗原用前要充分摇匀，瓶底应无血球沉淀。一次实验过程应选择同一批无血球沉淀。一次实验过程应选择同一批号的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避号的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避免滴头和孔内的液体直接接触。免滴头和孔内的液体直接接触。 六、实验过程优化六、实验过程优化l6、振荡混匀、振荡混匀l将血凝板置于微量振荡器上振荡将血凝板置于微量振荡器上振荡 10 秒钟，秒钟，如无振荡器，用手轻轻摇匀即可。然后将如无振荡器，用手轻轻摇匀即可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血

18、球是否混血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，以没有血球沉淀为合格。盖上玻板，匀，以没有血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或室温下或 37下静置下静置 2 小时，判定结果，小时，判定结果，也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。七、判定标准七、判定标准l将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1 16孔孔和稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉于孔底和稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血凝集（血球大部分沉于孔底，边缘稍有少量血球凝集）。阳球大部分沉于

19、孔底，边缘稍有少量血球凝集）。阳性对照血清性对照血清 1 2 到到 1 256 各孔（各孔（18 孔）应出现孔）应出现“+”到到“+”凝集为合格（少量血球沉于孔底，凝集为合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如图大部分血球凝集）。如图 1 所示，该阳性血清滴度所示，该阳性血清滴度为为1 512 倍或记为倍或记为 9log2。七、判定标准七、判定标准l在对照孔合格的前提下，观察待检血清各在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现孔，以呈现“+” 凝集的最大稀释倍数为凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。因此正确识别该份血清的抗体效价。因此正确识别“+”的凝集现象是最后结果判定的先决的凝

20、集现象是最后结果判定的先决条件。一般的判定方法是将血凝板放在白条件。一般的判定方法是将血凝板放在白纸上，在各对照孔符合要求的前提下，从纸上，在各对照孔符合要求的前提下，从开始出现沉淀的孔观察起，至血球全部沉开始出现沉淀的孔观察起，至血球全部沉淀孔，综观这几孔，前后对比血球凝集和淀孔，综观这几孔，前后对比血球凝集和沉淀的发展情况，以沉淀的发展情况，以1/2血球沉淀孔的血血球沉淀孔的血清稀释倍数为该份血清的效价。清稀释倍数为该份血清的效价。 七、判定标准七、判定标准附：血凝试验强度附：血凝试验强度七、判定标准七、判定标准l例如例如 1 号待检血清号待检血清15孔呈现孔呈现“+”到到“+”凝集，凝集，67 孔呈现孔呈现“+”凝集，凝集，第第8孔呈现孔呈现“+”凝集，第凝集，第 9 孔不凝集，那孔不凝集，那么就可判定该份血清的抗体效价为么就可判定该