急性运动中线粒体的抗氧化分子调控

1、急性运动中线粒体的抗氧化分子调控        【摘要】  线粒体是细胞内活性氧的主要来源。研究证实解偶联蛋白具有质子转运活性，能够减少线粒体活性氧的产生。而线粒体抗氧化酶也是机体重要的抗氧化防御机制。解偶联蛋白和抗氧化酶的激活和/或诱导表达可能在急性运动过程中的机体抗氧化保护中共同发挥作用，从而保持活性氧稳态，维持细胞正常功能。 【关键词】  急性运动；线粒体；活性氧；解偶联蛋白；抗氧化酶基金项目：国家基金（No.30270638和No.30470837）共同资助。1978年Dillard等1

2、首次报道了人以50%最大摄氧量负荷踏车运动1小时后，呼出气中脂质过氧化产物戊烷含量明显增加。之后Davies等2又于1982年应用ESR技术直接检测到力竭运动后大鼠肝脏、骨骼肌中的自由基信号。目前急性运动应激状态下机体活性氧（ROS）生成及其引发的脂质过氧化水平升高已为大量研究所证实。活性氧的大量产生会导致机体细胞和组织的广泛氧化损伤，并被认为是运动性疲劳发生的重要机制之一。研究发现，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，构成生物体活性氧生产量的95%以上3。体内活性氧在生成的同时也在不断地被清除。在生物进化过程中，线粒体形成了自身的一套抗氧化防御体系，以减缓活性氧的损伤攻击，其中温和解偶联抑制O2

3、的单还原及抗氧化酶的作用是两个重要的方面。1  线粒体温和解偶联抑制活性氧生成、解偶联蛋白家族成员（UCPs）及其与运动    线粒体态4呼吸向态3呼吸的转变能够完全阻止H2O2的累积，除了还原性呼吸载体的总量减少外，主要在于降低了半醌QH的生存期4。温和解偶联导致跨膜电位的轻微下降，就能阻断线粒体内超氧阴离子（O-·2）的积累过程。Nichols（1974）首次证实线粒体质子漏现象的存在。质子漏指在缺乏磷酸化受体ADP的情况下，质子（H+）不通过F0F1-ATPase进行ATP合成，而直接通过线粒体内膜回到基质，其结果导致贮存在质子电化学势能

4、中的自由能被消耗。可以认为，质子漏的发生减缓了线粒体内膜两侧电化学势的升高，减小了电子沿呼吸链传递的阻力，刺激了分子氧的消耗，缓解了O-·2的生成。单纯的磷脂双分子层的物理特性不能满意解释生理条件下线粒体质子漏的机制问题。内源质子载体负责线粒体质子漏的设想很早就受到人们的重视，刘树森等5提出线粒体呼吸生成的O-·2是内源质子载体引起质子漏的设想。O-·2具有酸碱双重特性，在酸性的线粒体膜外侧，O-·2可吸收H+形成质子化的HO2；在碱性的线粒体膜内侧，HO2脱质子化可释放H+。质子化形成的HO2在膜脂中有较大的溶解性，易跨膜转移，是理想的单个H+ 的“载

5、体”。此外，已发现的UCPs被证实具有质子转运活性。目前在人和动物体内发现的UCPs主要有UCP-1、UCP-2和UCP-3，在脑线粒体内膜上还发现两种具有解偶联活性的蛋白质UCP-4和UCP-5（BMCP1）。UCPs具有对质子的转运活性，可引起质子经线粒体内膜回漏（即质子漏）增加，使合成ATP所依赖的线粒体质子跨膜梯度降低，ADP磷酸化合成ATP的效率下降，氧化与磷酸化解偶联。    运动作为一种剧烈的刺激因素可以激发机体的应答反应。运动应激状态下ROS大量生成已被广泛证实，线粒体跨膜电位直接控制ROS的产生，UCPs可通过解偶联抑制分子氧的单电子还原而具有抗

6、氧化应激的作用。Patrick等6发现急性运动对UCP-3L mRNA表达没有直接的影响，但在禁食状态下，运动后4小时UCP-3L mRNA的表达水平较安静时、运动后即刻和运动后2小时显著升高（平均约106%），实验中没有观察到运动中和运动后UCP-3S mRNA表达和UCP-3蛋白含量有明显变化。Zhou等7发现急性跑台跑能迅速（30分钟）诱导大鼠骨骼肌UCP-3 mRNA表达，200分钟后达到7倍，而UCP-3蛋白相应增加46倍。Tsuboyama-Kasaoka等8人报告经过一个小时的训练后，大鼠的腓肠肌和四头肌的UCP-3表达上调，在训练后的24小时内UCP-3表达的上调又会迅速消失。

7、人体剧烈运动对UCP-3的表达没有影响，或仅仅使UCP-3一过性上调9。运动诱导的UCP-3上调的机制不明。UCP-3的迅速诱导表达提示它在运动中具有重要作用。2  活性氧清除的酶系统与运动    线粒体内的抗氧化物包括低分子量的活性氧清除剂，如还原型谷胱甘肽（GSH）、NADPH、维生素E（VE）和维生素C（VC）等和催化过氧化物和氢过氧化物降解有关的酶。线粒体内主要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD，主要是Mn-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、NAD（P）转氢酶、巯基过氧化物酶等10。

8、另外，在大鼠心肌线粒体内还发现有过氧化氢酶（CAT）11。这些抗氧化体系阻止体内活性氧的过度产生或抑制它们对线粒体膜结构的损伤攻击。    剧烈的急性运动可诱导细胞和组织抗氧化状态改变。多数研究表明，一次急性运动可引起心肌、骨骼肌和肝脏等组织SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的活性增高12。对于在运动中相对较短的时间内抗氧化酶被激活的机制还不清楚，仍缺乏抗氧化酶在哺乳动物组织动力学和分子调节方面的资料。现在认为，抗氧化能力的改变主要是由于运动中活性氧高水平的产生。在原核生物，活性氧应答基因已被确定，即oxyR和soxR，分别控制着CAT和SOD的表达13。近年来，真

9、核细胞的抗氧化酶的调节也逐渐被揭示。最近，对于哺乳动物组织抗氧化酶基因表达信号转导途径进行了广泛的研究，已确定两种转录因子AP-1和NF-B起重要的作用13。NF-B可被多种包括活性氧在内的过氧化物所激活。在受到刺激后，抑制性的亚单位I-B从主成分（p50和p65）上分离，可使主成分移入细胞核成为潜在的抗氧化酶的诱导剂14。增加的活性氧可以通过上述机制或一些尚未明确的分子机制，急性或慢性地诱导相应抗氧化酶的产生。但另外一些因素诸如血流的改变、能量状态和还原态能量利用能力也可以影响各种组织抗氧化功能15。运动诱导ROS生成增多被认为是运动中Mn-SOD活性及其表达变化的原因。Nobushige

10、Yamashita等16的实验结果表明：（1）ROS诱导TNF-和IL-1；（2）ROS介导这些细胞因子激活Mn-SOD；（3）使用TNF-的心肌保护作用是通过ROS生成介导的。他们认为，运动中产生的ROS使心肌TNF-和IL-1水平升高，细胞因子在早期激活Mn-SOD，并可能在心肌保护后期通过产生ROS诱导Mn-SOD。在运动激活的信号通路中，ROS同时存在于细胞因子的上游和下游。3  解偶联蛋白与抗氧化酶对运动氧化应激的反应及其关系    急性运动应激过程中线粒体会产生大量ROS。Brand等17在Nature（2002）报道证实，O-·2

11、既可引起质子从膜外回漏导致解偶联，又可在线粒体基质内直接激活线粒体内膜上解偶联蛋白。UCP-2或UCP-3在O-·2的激活下可作为线粒体基质中的质子跨膜转运的关键蛋白（特异分子载体）等提示，在线粒体呼吸链ROS生成过量时，作为反馈应答，UCPs可通过呼吸链的轻度解偶联途径降低ROS生成，保护线粒体不受氧化损伤。另有研究表明，急性运动可以诱导骨骼肌UCP-2 mRNA和UCP蛋白表达增强，即急性运动可以在转录和转录后水平影响UCP基因表达7。急性运动诱导的线粒体以UCPs质子升高为特征的解偶联作用，可能也与降低ROS生成有关7。而急性运动又可诱导SOD、CAT和GPx等抗氧化酶活性的增

12、强。只是由于尚不了解各种主要抗氧化酶在运动中激活或其基因表达的时间进程，因而抗氧化酶系统对氧化应激的应答机制也不十分清楚18。由此可见，UCPs和抗氧化酶的激活和/或诱导表达可能在运动过程中的机体抗氧化保护中共同发挥作用。我们的研究认为19-21，长时间运动中以UCP-3的先行诱导表达对线粒体氧化还原状态进行调节，只有当线粒体内的ROS积累达到一定程度（阈值），才逐渐激活Mn-SOD表达以加强抗氧化的防线。相对于Mn-SOD来说，UCP-3的诱导表达是运动中抗氧化的“早期事件”。 UCP-3的先行激活是在一定范围内调节并保持有利于线粒体能量合成的氧化还原状态，具有灵敏和精细的特征，而Mn-SO

13、D才在真正意义上起到抗氧化的作用。运动氧化应激状态下线粒体的抗氧化作用直接关系到自身氧化还原状态，并进而影响其能量转换和ATP合成，这对于机体运动能力来说是至关重要的。目前关于抗氧化的研究已经取得了丰硕的成果，但也存在不少空白有待于填补。运动中的抗氧化问题仍然值得深入研究。1         【】  1 Dillard CJ,Litov RE,Savin WM,et al.Effects of exercise,vitaminE,and ozone on pulmonary function and li

14、pid peroxidationJ.J Appl Physiol,1978,45(6):927-932.2 Davies KJ,Quintanilha AT,Brooks GA,et al.Free radicals and tissue damage produced by exerciseJ.Biochem Biophys Res Commun,1982,107(4):1198-1205.3 Shigenaga MK,Hagen TM, Ames BN.Oxidative damage and mitochondrial decay in agingJ.Proc Natl Acad Sci

15、 USA,1994,91(23):10771-10778.4 Massey V.Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteinsJ.J Biol Chem，1994,269(36):22459-22462.5 Liu SS,Jiao XM,Wang XM,et al.Interaction of electron leak and proton leak in respiratory chain of mitochondriaJ.Science in China (Series C)，1996,39(2):168-178.6

16、 Patrick S, Matthijs H.Uncoupling protein 3 and physical activity:the role of uncoupling protein 3 in energy metabolism revisitedJ.Proceedings of the Nutrition Society,2003,62:635643.7 Zhou M,Lin BZ,Coughlin S.UCP-3 expression in skeletal muscle:effects of exercise,hypoxia,and AMP-activated protein

17、kinaseJ.Am J Physiol Endocrinol Metab,2000,279:E622-629.8 Tsuboyama-Kasaoka N,Tsunoda N,Maruyama K,et al.Up-regulation of uncoupling protein 3(UCP-3)mRNA by exercise training and down-regulation of UCP-3 by denervation in skeletal musclesJ.Biochem Biophys Res Comm,1998,247: 498503.9 Schrauwen P,Troo

18、st F,Xia J.Skeletal muscle UCP-2 and UCP-3 expression in trained and untrained male subjectsJ.Int J Obes Relat Metab Disord,1999,23:966-972.10 Gardner PR.Superoxide-driven Aconitase Fe-S center cyclingJ.Bioscience Report,1997,17:33-42.11 Radi R, Turrens JF, Chang LY,et al.Detection of catalase in ra

19、t heart mitochondriaJ.J Biol Chem,1991,266(32): 22028-22034.12 Ji LL.Exercise and free radical generation: Role of cellular antioxidant systems/Holloszy J.Exercise and Sports Science ReviewM.Baltimore,Maryland:Williams & Wilkins Co,1995:135-166.13 Sen CK, Packer L.Antioxidant and redox regulatio

20、n of gene transcriptionJ.FASEB J,1996,10:709-720.14 Meyer MR,Schreck R,Raeuerle PA.H2O2 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-B and AP-1 in intact cells:AP-1 as secondary antioxidant-responsive factorJ.EMBO J,1993,12:2005-2015.15 Ji LL,Leichtweis SL.Exercise and oxidant stress:Source of free radicals and their impact on antioxidant systemsJ.Age,1997，20