猪瘟疫苗研究进展赵耘pdf

1、动物医学进展, 2004, 25 (1) : 39 42P rog ress in V eterina ry M ed icineX222 2猪瘟疫苗研究进展赵耘, 宁宜宝(中国兽医药品监察所, 北京 100081)中图分类号: S852. 651; S858. 28 文献标识码: A文章编号: 1007 5038 (2004) 01 0039 04摘要: 猪瘟是猪的一种高度接触性传染病, 由 于其造成巨大的经济损失, 故而为清除本病作 了很多工作。猪瘟疫苗的接种是控制猪瘟的重 要手段。猪瘟疫苗包括灭活苗、弱毒苗及基因工 程疫苗。猪瘟兔化弱毒苗因其优良的免疫原性 是目前猪瘟防治应用最为广泛的疫

2、苗之一。基 因工程疫苗是目前猪瘟疫苗研究的热点领域, 其包括亚单位疫苗、合成肽苗、活载体苗、核酸 疫苗等。值得一提的是猪瘟病毒标记疫苗研究 近年来发展迅速, 目前已出现商品化的亚单位 标记疫苗, 可使猪瘟疫苗接种和自然感染区别 更为简单、快捷。本文就猪瘟疫苗的发展及应用 作了简要介绍。关键词: 猪瘟; 灭活苗; 弱毒苗; 基因工程疫苗猪瘟是猪的一种高度接触性病毒性疾病, 对养猪业 影响很大。1984 年国际兽疫局(O IE ) 将其列入A 类传 染病, 我国目前也将其定为- 类传染病。猪瘟的防制历 来是全世界猪瘟存在国非常重视的课题, 为此各国都投 入了大量的人力、物力, 并取得了很大的成绩。

3、疫苗和疫 苗接种是控制猪瘟的重要手段。我国是以疫苗接种为防 制猪瘟主要手段。猪瘟疫苗的发展经历了早期的灭活 苗、弱毒苗到现在的基因工程疫苗。本文就猪瘟疫苗的 发展、应用作简要概述, 以期为猪瘟的最终控制和消灭 提供理论依据。1猪瘟灭活苗过去使用结晶紫制备灭活苗。皮下注射灭活苗安全 性良好, 但注苗后的免疫力通常不高, 免疫应答延迟, 既 使在数次加强免疫注射后也只能持续几个月。注苗猪对 强毒攻击虽然表现良好的临床抵抗力, 却对病毒感染敏 感, 而且强毒能穿透母体组织而感染胎儿。Do rset 等首先创制了猪瘟结晶紫灭活苗和组织疫 苗。我国马闻天等 1947 年试制过猪瘟灭活疫苗。何正 礼、方时

4、杰、胡祥璧及李崇道等于 1951- 1952 年相继报 道用不同毒株试制疫苗成功, 其中以石门系毒株血毒 苗, 效果最好。结晶紫甘油(0. 25% ) 和血毒之比为41, 38 减毒 5 7 d 都可制出好疫苗。田间试验结果表明 注苗后 6 个月和 10 个月仍有良好的保护力 1 。另外D henn in ( 1976 年) 报道用野毒株 A lfo rt A 19 株在PK 15 细胞上增殖培养, 病毒经超滤浓缩、聚合甘油醛 灭活、加油佐剂制成灭活油苗, 猪皮内接种 2. 5 mL , 接种两次, 或 1 次皮内接种 5 mL , 免疫 2 个月后进行强毒 攻击, 结果完全保护, 保护力至少

5、持续 1 年以上。2猪瘟弱毒苗2. 1兔化弱毒自 1946 年开始, 国外相继有 B aker ( 1946 )、Ko 2 p row sk i 等人报告用不同方法将不同的猪瘟病毒适应 于家兔, 成为对猪毒力减弱的变异毒株。但这些变异毒 株接种猪仍可诱发严重反应及死亡。我国 1954 年成功培育出猪瘟兔化弱毒株并制成疫 苗 (CL S) , 也叫“C 株”或“K 株”。疫苗病毒的复制主要 在淋巴样组织, 特别是扁桃体, 但有时能从肾脏检查出 苗毒抗原。该苗毒株虽然可以通过怀孕猪的胎盘屏障, 但不感染胎儿引起任何畸变。猪瘟兔化弱毒株毒力不返 强, 在猪体内连续传代后仍保持原弱毒的特性。对乳猪 和

6、种猪无残余毒性。接种各年龄的各品种猪, 不产生猪 瘟临床症状, 仅出现轻微病毒血症, 免疫后 4 32 d 内, 免疫猪不从尿中排毒, 免疫猪与非免疫猪同圈饲养60 d, 不发生接触感染。检查免疫猪脏器带毒情况, 证明 免疫后 7 d 的猪体中脾及液中血尚存微量毒, 17 d 以 后, 免疫猪的血液、脾及骨髓中已均无病毒存在。免疫 10 14 日龄哺乳仔猪, 不影响发育, 注射怀孕 1 3 月 母猪, 不引起流产、死胎 1 。中国兔化弱毒能否在传代细胞系培养这是上世纪80 年代末期到 90 年代初猪瘟兔化弱毒疫苗株研究的 热点之一。R ivero (1988 年) 等报道将猪瘟兔化弱毒C 株在

7、M PK 细胞及R K 细胞上适应培养, 结果C 株更适 应在M PK 细胞上增殖, 而且在M PK 细胞上增殖后对 兔子的毒力有所增强。1990 年 R ivero 等利用已适应M PK 细胞的猪瘟兔化弱毒制苗对 2 月龄猪进行免疫, 然后进行强毒攻击, 结果在免疫猪未发现病毒复制。随 后Gua land i (1991)、Ferra ri (1992) 等分别利用猪瘟兔化 弱毒适应M PK 细胞制苗, 得到了相似的结果, 其抗原 性不变, 滴度及免疫原性比兔体淋脾毒高, 免疫持续期 长达 11 个月, 6 个月或 11 个月后强毒攻击, 免疫猪能 抵抗强毒攻击, 能产生高水平的抗体。SK

8、6 是另一个猪 瘟兔化弱毒适应研究的传代细胞系。T erp st ra 等 1990 年报道利用猪瘟兔化弱毒适应 SK 6 细胞制苗, 400 600 TC ID 50 剂量免疫后, 7 d 或 6 个月后用大于LD 50 剂量强毒攻击, 结果均能完全保护。这意味着适应传代细 胞系的猪瘟兔化弱毒不仅可以用作一种廉价的疫苗, 而 且还可望提供一个更为有效的猪瘟疫苗制备方法。近年来, 猪瘟兔化弱毒口服免疫的研究日趋增多。 口服免疫可以极大地减少猪瘟免疫的工作强度, 使用简X 收稿日期: 2003204215基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目(G1999011905) ; 国家自然科学基金重大

9、项目(398932902122)作者简介: 赵耘(1968- ) , 女, 副研究员, 博士, 主要从事动物传染病学、分子病毒学研究。40动物医学进展2004 年第 25 卷第 1 期(总第 129 期)便。Chenu t 等 1999 年报道利用C 株口服免疫家猪、野Pest i”亚单位商品化疫苗免疫哺乳仔猪, 对哺乳仔猪的猪、绵羊、家兔及野兔, 结果家猪免后 4 d 扁、脾、淋巴免疫程序进行了研究, 结果两次免疫间隔 4 周、2 免后结、胸腺、粪及尿中分离不到病毒, 3 周血清学阳转, 免14 d 攻毒组免疫猪无临床症状、无病毒血症、不排毒,后 6 周攻毒, 能完全保护强毒攻击; 7

10、46;8 野猪免后血清两次免疫间隔 4 周、2 免后同时攻毒组免疫猪排毒; 两抗体阳性, 扁和脾分离不到病毒; 绵羊接种后不表现临次免疫间隔 2 周, 2 免后 14 d 攻毒组免疫猪只在攻毒后床症状, 血清抗体阴性; 家兔接种后表现轻度热反应; 野第五天出现病毒血症, 但不排毒, 两次免疫间隔 2 周、2兔则无症状; 家兔和野兔二者有少数表现血清学抗体阳免后 7 d 攻毒组免疫猪排毒; 一次免疫、14 d 后攻毒则性 2 。Kaden 等 2001 年报道以C 株对断奶仔猪进行口不能抵抗强毒攻击 11 。服免疫, 结果进行大剂量 Ko slov 强毒株攻击的免疫猪3. 2猪瘟合成肽苗2

11、46;2ö2ö死亡; 3 5 进行小剂量A lfo rt187强毒株攻击的免疫猪利用重组DNA 技术根据病毒基因组的核苷酸序存活, 血清抗体阳性, 但从鼻腔排毒, 其中 4 只猪表现瞬列, 可推导出病毒蛋白质的氨基酸序列, 从而可用人工时病毒血症; 而所有进行M V 140R iem s 低毒力毒株的合成方法制备病毒主要抗原相应的寡肽, 制备合成肽免疫猪均存活, 表现短时病毒血症, 均有抗体, 但所有存苗。Dong 等报道合成 5 段猪瘟石门株B C 区 693 777活猪体内均无CSFV 或CSFV RNA 3 。同年Soo s 等报位氨基酸, 偶联B SA 制成合成肽苗

12、, 结果免疫猪能产生道以C 株在分娩前 167 217 d 口服免疫母猪, 结果所高滴度的抗体, 并能完全保护强毒的攻击。并以此多肽有 3周龄及 80% 6周龄仔猪中和抗体滴度为 140,制备高免血清, 此血清14 和16 稀释后能抑制C 株25%10 周龄仔猪中和抗体滴度达到 120, 所有仔猪的兔体热反应, 而用合成多肽对高免血清进行亲和层析EL ISA 抗体检测均为阳性 4 。处理后, 则不能抑制C 株的兔体热反应 12 。2. 2低温细胞培养猪瘟弱毒苗3. 3猪瘟活载体疫苗(1) GPE 株。此弱毒株是 1959 年由日本的 Sa sa是将外源目的基因用重组DNA 技术克隆到活的ha

13、ra 研制的。选用的毒株是ALD 强毒株, 采取的方法载体病毒中制备的一种疫苗, 可直接用这种疫苗经多种是将ALD 株在猪睾丸细胞通过 142 代, 随后用终点稀途径免疫动物。目前研究最多的是痘病毒。其他作为候释法选出纯系毒株, 再通过牛睾丸细胞 26 代减毒, 如上选病毒载体还有腺病毒、乳多空病毒、口疮病毒、禽痘病挑选纯系毒株, 再适应于豚鼠肾细胞传 41 代, 最后用鸡毒、伪狂犬病毒等。痘苗病毒拥有广泛的宿主范围, 毒性新城疫病毒强化法选出 END 阴性纯系毒株, 该毒株能低, 是较早作为生产基因重组疫苗的载体之一。R um e很好的在 30 温度中增殖。以此毒株制苗, 无残余毒nap f

14、 (1991) 等将编码 CSFV 结构蛋白基因插入痘苗病力, 成功的控制了日本的猪瘟 5 。毒的 T K 基因中, 获得了能表达该结构蛋白的重组痘苗( 2) T h iverva l 株。是 1976 年法国的A ynaud 所研病毒, 将这种重组病毒免疫猪, 可使猪抵抗强毒攻制。选用的毒株是A lfo rt 强毒, 采取的方法是将强毒击 13 。随后 1995 年 Kon ig 等将编码CSFV N p ro、E 0、A lfo rt 株用 PK 15 细胞培养于 29 30 连续传 170E 1 和 E 2 基因分别插入痘苗病毒中, 获得了能表达 E 2代, 通过终点稀释法选出一株纯系弱

15、毒。这个温度变异或 E 0 蛋白的重组病毒, 免疫猪能获得针对致死剂量强毒株对各种年龄的猪均安全有效, 保持坚强免疫原性,毒攻击的保护 14 。2001 年H ahn 等报道构建了重组猪目前在法国已推广使用, 控制猪瘟效果较好 5 。痘病毒, 结果重组病毒在猪源、猴源和人源细胞上均表3猪瘟基因工程疫苗现减毒。以此表达CSFV E 2 蛋白, 结果E 2 蛋白以二聚3. 1猪瘟亚单位苗体形式存在于感染细胞胞浆内 15 。是将编码某种特定蛋白质的基因组, 与适当质粒或伪狂犬病毒是另一个重要的活病毒载体, 外源基因病毒载体重组后导入受体(细菌、酵母或动物细胞) , 使可稳定地插入其DNA 。已证实将

16、CSFV 的 E 2 基因插其在受体中高效表达, 提取所表达的特定多肽, 加佐剂入伪狂犬的 gX 基因位点, 既不会改变伪狂犬病毒的细即制成亚单位苗。E 2 蛋白是猪瘟病毒主要保护性抗原,胞或宿主嗜性, 也不会使伪狂犬病毒的毒力发生变化。能诱导机体产生中和抗体, 保护机体免受强毒攻击。因1991 年 van Ziji 等报道利用 PRV 减毒活病毒载体构建此 H u lst (1993)、Boum a (1999) 及 T sibezov (2000) 等分了 PRV 与 CSFV E 1 重组病毒, 结果接种猪能产生针别利用杆状病毒高效表达了CSFV E 2 蛋白, 分别用 20对 PRV

17、及 CSFV 高水平的中和抗体, 能抵抗 PRV 及LCSFV 强毒攻击 16 。Peeter (1997) 等构建了能表达CS2g、32 m g 及 200 m g E 2 蛋白免疫猪, 均能完全抵抗致死剂量强毒的攻击 68 。有关CSFV E 2 亚单位疫苗免疫öFV E 2 蛋白的 gD gE 双缺失的伪狂犬病毒重组疫苗,效果、能否阻止猪瘟病毒垂直传播及免疫程序等方面目免疫接种试验表明该活载体疫苗能使猪获得对伪狂犬前已作了很多工作。Boum a 等报道利用CSFV E 2 亚单 位疫苗肌肉接种免疫猪, 分别在免疫后 14, 10, 7 d 进行 B rescia 株强毒攻击,

18、结果免疫后 14 d 及 10 d 攻毒组免 疫猪不散毒, 而免疫后 7 d 攻毒组免疫猪散毒 9 。D e Sm it 等报道利用CSFV E 2 蛋白亚单位疫苗在人工授 精前后 1 次或 2 次免疫母猪, 人工授精后 6 周中等毒力和猪瘟的双重保护 17 。 腺病毒是另一个用得较多活病毒载体。H amm ond等 2000 年构建了CSFV W eyb ridge 株 gp 55 (E 2) 基因 重组腺病毒( rPAV ) , 免疫猪能抵抗强毒攻击, 且攻毒 后无任何临床症状, 剖检无任何病理变化 18 。随后在 2001 年又对此重组腺病毒疫苗免疫途径进行了试验,猪瘟病毒攻毒, 攻毒后

19、 5 周剖杀, 结果 1 次免疫猪攻毒 结果免疫及攻毒途径均为皮下接种组免疫猪能抵抗强 后 1ö9 母猪所产胎儿可分离到病毒, 而 2 次免疫猪则接 毒攻击, 免疫接种途径皮下和口服、攻毒途径口服的接 毒后母猪所产胎儿均未分离到病毒 10 。目前CSFV 亚 种组保护率为 60% ; 皮下接种免疫猪 60% 的猪在攻毒 单位疫苗已有商品化产品, Zieg ler 等报道利用“Po rcilis 前有中和抗体, 而口服接种免疫猪攻毒前均无中和抗赵耘等: 猪瘟疫苗研究进展41体 19 。4猪瘟标记疫苗4. 1猪瘟亚单位标记疫苗实际上就是猪瘟病毒 E 2、E 2 B öC 区或

20、E 2 A 区亚 单位疫苗, 与亚单位疫苗不同之处在于同时建立了相应备了 2 株E ( rn s) 基因突变株, F lc22 突变株是在E ( rn s)内缺失了 66 个氨基酸, F lc23 突变株只包括 E ( rn s) 最 C 端和最N 端氨基酸, 缺失了 215 个氨基酸。以此突变 株免疫猪能低抗强毒B rescia 株的致死性感染 27 。随 后, de Sm it (2001) 等报道构建了 2 株C 株E 2 基因突变的区别疫苗接种猪和自然感染猪的诊断方法, 目前所建株 F lc9 和F lc11。其中F lc9 突变株是将C 株E 2 基因C端由BVDV 5250 株同源

21、部分替代, F lc11 突变株是将C立的诊断方法多是以猪瘟病毒 E 0 基因表达蛋白为抗株E 0 基因被BVDV 同源基因替代。将 2 个突变株一次原, 结果疫苗接种猪不会产生针对 E 0 的抗体, 而自然免疫接种敏感猪, 免疫 1 2 周后用强毒B rescia 株或感染猪则产生针对 E 0 的抗体, 从而达到区别诊断的目的。V an R i jn 等早在 1999 年在实验室利用杆状病毒表B eh ring 株攻击, 结果均能提供较好的临床保护 28 。另达了CSFV E 2 (不包括跨膜区)、E 2 的A 区及 E 2 的B外, van Genn ip (2002) 等报道制备了 3

22、株C 株 E 2 基因C 区制成亚单位标记疫苗, 结果均能使免疫猪产生抵抗突变株 F lc4、F lc47 及F lc48。其中F lc4 缺失E 2 基因BC 区693 746 aa, F lc47 缺失 E 2 基因A 区 800 864 20 强毒攻击的保护。随后,M oo rm ann 等报道以CSFVaa, F lc48 缺失整个 E 2 基因 689 1 062 aa。以此3 个突E 2 亚单位标记疫苗 1 次鼻内接种免疫猪, 结果免后 3周及 6个月攻毒免疫猪不表现临床症状, 不散毒; 免后 变株皮内接种免疫猪, 结果 F lc4 能完全保护CSFV 强1,;2 周毒致死性攻击,

23、 而 F lc47 及 F lc48 只能对强毒致死性攻ö周攻毒免疫猪死亡散毒 能使哨兵猪感染 免后ö攻毒免疫猪部分散毒, 不能使哨兵猪感染; 同时以此疫苗进行了怀孕母猪的免疫, 结果 1 次免疫 1ö9 母猪发生 垂直传播, 而 2 次免疫则无 21 。de Sm it 等利用 E 2 亚单 位标记疫苗 1 次免疫猪得到了相似的结果, 免疫期可长 达 13 个月, 但免后 13 个月攻毒 1ö4 免疫猪攻毒时中和 抗体阴性, 攻毒后死亡 22 。利用 E 2 蛋白标记疫苗 1 次击提供部分保护。同时利用F lc23 进行了不同接种途径 的筛选试验, 结

24、果皮内接种能完全保护免疫猪对CSFV强毒致死性攻击, 而肌肉接种和鼻内接种只能对强毒致 死性攻击提供部分保护 29 。5猪瘟核酸疫苗用猪瘟病毒 E 2 蛋白基因的表达载体直接作为免免疫哺乳仔猪U t ten tha l 等的结果与M oo rm ann 等的疫动物的DNA 疫苗是近年来猪瘟病毒免疫研究的热结果相似, 免后 21 d 及 14 d 攻毒组免疫猪不表现临床点领域, DNA 疫苗可以诱导体液免疫, 又可诱导细胞免症状, 但可传播病毒给哨兵猪, 其中 25% 免疫后 21 d 攻疫。M a rkow ska D an iel 等报道CSFV DNA 疫苗免疫猪毒免疫猪可从白细胞中分离到

25、病毒, 而免疫后 14 d 攻后能完全保护强毒攻击, 但攻毒后有 2 d 体温高达毒 50% 的免疫猪可从白细胞中分离到病毒; 免疫后 1040 以上, 同时 T、B 淋巴细胞活性轻微增强。国内部d 及 7 d 攻毒免疫猪均可分离到病毒, 其中免疫后 10 d分专家也通过初步田间试验, 证实其有较好的免疫攻毒及 7 d 攻毒免疫猪出现慢性感染的分别为 5% 和力 30 。王宁(1999 年) 等报道构建了含有猪瘟病毒石门30% , 致死率分别为 20% 和 20% 80% 23 。而利用 E 2株囊膜糖蛋白(E 2) 基因的重组真核表达质粒pRCSE 2。亚单位标记疫苗 2 次免疫怀孕母猪D

26、ew u lf 的结果与将pRCSE 2 和空载体pRC 免疫小鼠, EL ISA 检测结果öö2M oo rm ann 的结果不同, 免后 10 d 攻毒, 3 8 怀孕母猪表明: 仅 pRCSE 2 免疫鼠可以产生猪瘟病毒的特异抗可发生垂直传播, 造成胎儿感染 24 。目前猪瘟亚单位标体。周鹏程(2000 年) 等报道构建了表达CSFV E 2 蛋白记疫苗也有商品化的产品, A h ren s 等报道利用CSFV的重组质粒p cE 2, 用脂质体转染法将p cE 2 导入 co s 7标记疫苗 Po rcilis Pest i 免疫母猪, 免疫次数为 2 次, 免细胞进

27、行瞬时表达, 用针对 E 2 蛋白的特异性单抗以间疫间隔为 4 周, 首免后 35 d 所有免疫猪 E 2 中和抗体水接免疫荧光法检测, 结果证实小鼠免疫后 2 周和 4 周抗平为 5. 0 7.5 log (2) , 首免后 126 d 低毒力毒株攻毒,体阳性, 同时中和实验也证实免疫后中和抗体也阳性。免疫组2 10猪在攻毒后第5天出现中等程度白细胞数, 随着兽医学、免疫学及分子生物学的发展, 猪总之2减少, 所有猪均不表现临床症状, 血中及鼻拭子中不能 瘟疫苗的研究将向着免疫效果更好、区别诊断方法更精 分离到病毒, 9ö10 免疫母猪所产仔猪未发生感染, 血 确、更简便的方向发展

28、, 为猪瘟最终控制和消灭奠定基 样、淋巴结和骨髓病毒检测阴性 25 。D ep ner 等报道分别 础。利用拜尔公司的B ayovac CSF 标记疫苗(疫苗A ) 及英 参考文献:特威公司的 Po rcilic Pest i 标记疫苗(疫苗B ) 免疫(妊娠25 周及 46 周) 怀孕母猪, 免疫次数分别为 1 次和 2 次, 14 d 后强毒攻击, 结果母猪抵御强毒攻击无论1 次免疫 还是 2 次免疫疫苗A 好于疫苗B , 其抗体水平明显高于 疫苗B。4. 2猪瘟C 株突变株标记疫苗是对猪瘟兔化弱毒进行改造, 使其缺失或替换某一 段基因, 而其免疫原性不改变, 缺失或替换的基因所表 达的蛋

29、白则可作为诊断抗原, 从而达到疫苗接种猪和自 然感染猪相区别。目前所研究的猪瘟C 株突变株标记 疫苗多是对猪瘟兔化弱毒进行 E 2 或 E 0 基因的部分缺 失、全缺失或替换。W id jo joa tm od jo (2000) 等报道利用 猪瘟C 株感染性克隆在 SK 6c26 细胞系上连续传代制 1 谢庆阁, 翟中和. 畜禽重大疫病免疫防制研究进展M . 北京: 中国农业科技出版社, 1996: 64 92. 2 Chenu t G,Sain tilan AF , Bu rger C , et al.O ral imm un isation ofsw ine w itha classic

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