端粒、端粒酶与肿瘤

1、端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 东南大学医学院病理学系端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的概念端粒的概念l端粒（端粒（telomere） 是真核生物染色体线性是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构，对分子末端的特殊结构，对维持染色体稳定性和维持染色体稳定性和DNA完整完整复制具有重要作用复制具有重要作用 。端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的发现端粒的发现 l20世纪世纪30年代末：年代末：Mller首先提出了首先提出了“端粒端粒” 概概念念l20世纪世纪70年代年代: Olovnikov 提出染色体分子末端的提出染色体分子末端的丢失丢失 细胞退出细胞增殖细胞退出细胞增殖l1978年年Bl

2、ackbum,et al. 发现四膜虫端粒分子末端发现四膜虫端粒分子末端是重复是重复 串联的串联的5 GGGGTT 3 DNA简单序列简单序列l1985年年Gueider,et al. 发现端粒酶发现端粒酶l1989/1992年间年间Lundblad,et al. 提出提出“端粒假说端粒假说” 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒假说的内涵端粒假说的内涵l细胞分裂细胞分裂 次数增加次数增加 端粒缩短端粒缩短 端粒缩短启动某些信号端粒缩短启动某些信号细胞停止分化和老化细胞停止分化和老化(M1期期) 病毒转化病毒转化/P53突变突变 细细胞继续分裂胞继续分裂,端粒进一步缩短端粒进一步缩短 细胞细胞 进入

3、进入M2期期 细胞死亡细胞死亡 端粒酶激活端粒酶激活 端粒功能恢复端粒功能恢复 细胞永生化细胞永生化端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的组成和结构端粒的组成和结构 l端粒是染色体上增大的末端染色体粒端粒是染色体上增大的末端染色体粒 原端粒（原端粒（protelomere） 常端粒（常端粒（utelomere）l电镜研究显示，端粒含有不规则折叠染色电镜研究显示，端粒含有不规则折叠染色质丝，每根纤丝直径约质丝，每根纤丝直径约23nm，这种纤丝，这种纤丝很少在染色体一端终结，而是弯回到染色很少在染色体一端终结，而是弯回到染色体中去。体中去。 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的组成和结构端粒的组成和结构lB

4、lackburn等发现四膜虫等发现四膜虫rRNA分子末端是一连串重分子末端是一连串重复的六核苷酸，复的六核苷酸， 序列为：序列为：3CCCCAA 5， 5GGGGTT 3 这种重复一般可达几十次，总长度为这种重复一般可达几十次，总长度为370bp-520bp。l1986年年Zalian等在纤毛虫中发现了与端粒等在纤毛虫中发现了与端粒DNA结合的特异性结合的特异性蛋白（蛋白（TRF1、TRF2），其分子质量分别为），其分子质量分别为55kd、41kd的二的二聚体蛋白质，结合在富含聚体蛋白质，结合在富含G的端粒的端粒DNA链上。象链上。象“帽子帽子”一一样保护端粒不受化学修饰或核酸酶的作用。端粒的

5、这些结构样保护端粒不受化学修饰或核酸酶的作用。端粒的这些结构蛋白与端粒酶有区别。细胞学观察端粒直蛋白与端粒酶有区别。细胞学观察端粒直/间接与核膜相连，间接与核膜相连，可能与染色体分离和细胞分裂有关。可能与染色体分离和细胞分裂有关。端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的功能端粒的功能 (1)l端粒端粒DNA和它的结合蛋白紧密结合，像和它的结合蛋白紧密结合，像二顶帽子盖在线性二顶帽子盖在线性DNA的两端的两端 使其末端具有惰性使其末端具有惰性 保持着遗传的稳定性保持着遗传的稳定性。 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的功能端粒的功能(2)l 端粒保证了染色体末端稳定的复制。按线性端粒保证了染色体末端稳定的复

6、制。按线性DNA分子的复制模型，在新复制的分子的复制模型，在新复制的DNA链的链的5-端将有一缺隙无法填补，细胞面临端将有一缺隙无法填补，细胞面临5-端逐渐缩端逐渐缩短。端粒的存在能减缓这一缩短趋势，使染色短。端粒的存在能减缓这一缩短趋势，使染色体近末端的遗传信息不致在复制中丢失体近末端的遗传信息不致在复制中丢失。端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒的功能端粒的功能(3)l Fussel曾报道用曾报道用3H-T对洋葱根尖细胞进对洋葱根尖细胞进行脉冲标记，发现在行脉冲标记，发现在G1、S、G2期，染色期，染色体的走向都和分裂末期的染色体一样，着体的走向都和分裂末期的染色体一样，着丝粒异染质聚集于核的一

7、边，而端粒则位丝粒异染质聚集于核的一边，而端粒则位于着丝粒的对侧，成散在分布。于着丝粒的对侧，成散在分布。据推测这据推测这种与核膜的紧密结合关系，维持着细胞染种与核膜的紧密结合关系，维持着细胞染色体的空间定向，使染色体所携带的信息色体的空间定向，使染色体所携带的信息能有秩序而又有效的复制和表达能有秩序而又有效的复制和表达。 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶的发现端粒酶的发现 l1984年年Shampay等在研究酵母染色体的端粒结构等在研究酵母染色体的端粒结构时发现时发现端粒的复制是一种无模板复制端粒的复制是一种无模板复制。l此后，此后，Blackburn实验室利用四膜虫的无细胞抽提实验室利用四

8、膜虫的无细胞抽提物在体外进行了端粒物在体外进行了端粒“加尾加尾”实验，结果发现：实验，结果发现： 端粒的加尾方向是按富端粒的加尾方向是按富G链的链的5端端3端，每次是以端，每次是以TTGGGG为一为一个单位重复加上个单位重复加上 这种这种“加尾加尾”是无模板的是无模板的 反应体系中有一种物质能特异性识别拟被加尾的末端序列反应体系中有一种物质能特异性识别拟被加尾的末端序列 催化反应的是一种具有酶活性的蛋白质，称为端粒转移酶催化反应的是一种具有酶活性的蛋白质，称为端粒转移酶端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶的结构端粒酶的结构 该酶系核糖核蛋白复合物该酶系核糖核蛋白复合物 蛋白质蛋白质 酶活性酶活性

9、RNA RNA 复制模板复制模板不同物种的端粒重复序列不同不同物种的端粒重复序列不同-保守性较差保守性较差l 四膜虫的模板区序列：四膜虫的模板区序列： 5，-CAACCCCAA-3，l 人的模板区序列：人的模板区序列： 5，CUAACCCUAAC-3， 模板区模板区 与端粒的末端结合定与端粒的末端结合定 延伸复制的模板延伸复制的模板 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶的结构端粒酶的结构l 发现四膜虫端粒酶是一种发现四膜虫端粒酶是一种RNA-蛋白质复蛋白质复合物（合物（RNP结构），分子质量在结构），分子质量在200kd-500kd，对，对RNA酶极为敏感，端粒酶内的酶极为敏感，端粒酶内的RNA和

10、蛋白质对其活性似乎都是必需的和蛋白质对其活性似乎都是必需的l 端粒酶的蛋白组分由一些亚单位构成，端粒酶的蛋白组分由一些亚单位构成，如端粒酶催化亚单位（如端粒酶催化亚单位（TERT），其共同特），其共同特点含有逆转录酶的大部分保守性序列点含有逆转录酶的大部分保守性序列。端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶的功能端粒酶的功能l细胞分裂细胞分裂 端粒缩短端粒缩短 端粒酶端粒酶 端粒亚单位合成端粒亚单位合成 端粒延长端粒延长 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶的功能端粒酶的功能l根据端粒根据端粒DNA以及端粒酶的特性提出了端粒延以及端粒酶的特性提出了端粒延长的长的“爬行爬行”模型（模型（inchworm m

11、odel）。）。 端粒合成必须有端粒合成必须有3 3个步骤个步骤：l端粒酶对已有的末端的识别和结合；端粒酶对已有的末端的识别和结合；l根据内含的根据内含的RNA模板添加互补的核苷酸并聚合模板添加互补的核苷酸并聚合l移位使端粒重复序列得以连续复制。移位使端粒重复序列得以连续复制。l端粒酶能够对端粒端粒酶能够对端粒DNA的富含的富含G-链进行加尾延长，而链进行加尾延长，而富含富含G-链又能通过链又能通过G-G配对使其终端形成回折，这样配对使其终端形成回折，这样DNA复制时新链复制时新链5-端缺失就可以得到补齐端缺失就可以得到补齐 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶活性的测定端粒酶活性的测定 l起初是

12、通过间接测定不同组织类型染色体中端粒的起初是通过间接测定不同组织类型染色体中端粒的平均长度变化来估侧端粒酶活性。平均长度变化来估侧端粒酶活性。l1994年报道了端粒重复序列扩增法（年报道了端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）以检测端粒）以检测端粒酶活性。该方法的酶活性。该方法的特点特点： 提取物制备：用去污剂而不是用低张法溶细胞提取物制备：用去污剂而不是用低张法溶细胞 以端粒酶催化引物延伸反应的产物作以端粒酶催化引物延伸反应的产物作PCR的模的模板，通过寡核苷酸引导的板，通过寡核苷酸引导的DNA合成和链的分离不断合成和

13、链的分离不断循环，使端粒酶反应产物成指数式的扩增，其灵敏循环，使端粒酶反应产物成指数式的扩增，其灵敏度比常规分析法的高度比常规分析法的高104倍倍端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶与细胞生长端粒酶与细胞生长 l染色体端粒染色体端粒DNADNA长度的恒定长度的恒定： 端粒增长（端粒酶合成）端粒增长（端粒酶合成） 缩短（细胞分裂时缩短（细胞分裂时DNA复制复制 )l端粒酶基因低表达端粒酶基因低表达 端粒端粒DNADNA序列会逐渐变短序列会逐渐变短 细胞变得衰老细胞变得衰老 细胞的死亡细胞的死亡 端粒与端粒酶端粒与端粒酶-端粒酶与细胞生长端粒酶与细胞生长lHerley等在未转化的、培养的人成纤维细胞中

14、发现等在未转化的、培养的人成纤维细胞中发现 端粒的长度随分裂次数的增加而缩短；端粒的长度随分裂次数的增加而缩短； 其端粒长度与细胞的年龄呈负相关；其端粒长度与细胞的年龄呈负相关； 体细胞的端粒长度大大短于生殖系细胞体细胞的端粒长度大大短于生殖系细胞。l 高等真核生物端粒很长，如人胚细胞约高等真核生物端粒很长，如人胚细胞约10kb；低等动物如；低等动物如纤毛虫不超过纤毛虫不超过100bp，与之相对应的是，正常哺乳动物体细胞，与之相对应的是，正常哺乳动物体细胞中端粒酶活性低甚至缺乏，而低等真核生物中则有高活性的端中端粒酶活性低甚至缺乏，而低等真核生物中则有高活性的端粒酶以维持染色体的稳定。粒酶以维

15、持染色体的稳定。l此外，端粒的长短还和细胞分化程度相关，分化程度越高，此外，端粒的长短还和细胞分化程度相关，分化程度越高，端粒端粒DNA越短。如人胚细胞端粒平均长度越短。如人胚细胞端粒平均长度10kb，人精细胞，人精细胞9kb，而一般正常体细胞只有而一般正常体细胞只有4kb 端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 （1）l许多研究表明，在基因突变、肿瘤形成时，许多研究表明，在基因突变、肿瘤形成时，端粒可表现出端粒可表现出缺失缺失、融合融合和和序列缩短序列缩短等异常等异常现象。现象。l B B细胞淋巴样白血病细胞淋巴样白血病端粒融合端粒融合易位型染色体易位型染色体l在大部分肿瘤染色体端粒缺失和端粒

16、融在大部分肿瘤染色体端粒缺失和端粒融合。端粒融合的占合。端粒融合的占20%-30%20%-30%，而且融合可在任何染，而且融合可在任何染色体上随机出现。环形染色体可由端粒联合而形色体上随机出现。环形染色体可由端粒联合而形成，通过产生染色体融合类型的亚克隆可引起染成，通过产生染色体融合类型的亚克隆可引起染色体不稳定，并最终导致环形染色体的丢失。色体不稳定，并最终导致环形染色体的丢失。端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 （2）l近年来发现，在结肠癌、乳腺癌等肿瘤中，端粒近年来发现，在结肠癌、乳腺癌等肿瘤中，端粒序列长度明显缩短。端粒序列缩短可能是导致肿序列长度明显缩短。端粒序列缩短可能是导致肿瘤

17、形成的一种分子水平的改变，是肿瘤细胞的一瘤形成的一种分子水平的改变，是肿瘤细胞的一种标志。无限增殖的细胞如种标志。无限增殖的细胞如Hela细胞，有极高的细胞，有极高的端粒酶活性，这也许是因为短端粒与某些致癌因端粒酶活性，这也许是因为短端粒与某些致癌因素协同刺激，使细胞生长趋势加强。素协同刺激，使细胞生长趋势加强。l正常体细胞和正常衰老细胞中几乎没有端粒酶正常体细胞和正常衰老细胞中几乎没有端粒酶的活性，而有些恶性细胞中却有很高的端粒酶活的活性，而有些恶性细胞中却有很高的端粒酶活性。性。 端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 （3）l端粒酶为何能促使癌症的形成？（端粒酶为何能促使癌症的形成？（ 1

18、990 ）l细胞增殖细胞增殖 端粒变短端粒变短 ？ 激活端粒酶激活端粒酶 细胞死亡细胞死亡 细胞永生化细胞永生化端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 （4）有人提出这样一种假设：有人提出这样一种假设：l体细胞的增殖端粒缩短当端粒缩短到一个阈值水平某些信号某些信号 阻止细胞进一步分裂.l如果有促发癌的遗传突变阻止这种安全信号的发送，或者因各种原因致这些信号未被细胞接受，那么细胞将越过正常的衰老进程继续分裂获得细胞的永生化特征。端粒、端粒酶与肿瘤端粒、端粒酶与肿瘤 （5）要揭示端粒与肿瘤的关系，须回答的问题要揭示端粒与肿瘤的关系，须回答的问题端粒的不断缩短是否导致细胞衰老？端粒的不断缩短是否导致细

19、胞衰老？ 激活端粒酶使细胞的端粒稳定，能使细胞无限制地激活端粒酶使细胞的端粒稳定，能使细胞无限制地 分裂？分裂？关键的问题是必须阐明恶性细胞的端粒酶何时和如关键的问题是必须阐明恶性细胞的端粒酶何时和如何被激活，是其何被激活，是其RNA组分抑或是蛋白质组分决定组分抑或是蛋白质组分决定端粒酶活性？端粒酶活性？活性是在转录前抑或在转录后起作用？活性是在转录前抑或在转录后起作用？肿瘤发生过程中的哪一个阶段端粒酶被激活？肿瘤发生过程中的哪一个阶段端粒酶被激活？ 端粒酶在肿瘤诊断中的应用（端粒酶在肿瘤诊断中的应用（1）l近年的研究结果表明：近年的研究结果表明： 恶性肿瘤组织端粒酶的检出率高达恶性肿瘤组织端

20、粒酶的检出率高达84%-95%， 良性瘤和正常组织的端粒酶检出率仅为良性瘤和正常组织的端粒酶检出率仅为4%左右左右l头颈扁平细胞癌：头颈扁平细胞癌：Mao等检测了等检测了16株头颈扁平株头颈扁平细胞癌细胞株，均有端粒酶活性；细胞癌细胞株，均有端粒酶活性；26/29例浸润性例浸润性头颈扁平细胞癌有端粒酶活性；头颈扁平细胞癌有端粒酶活性； Mutirangura检检测了测了14/16例头颈扁平细胞癌端粒酶呈阳性。例头颈扁平细胞癌端粒酶呈阳性。端粒酶在肿瘤诊断中的应用（端粒酶在肿瘤诊断中的应用（2）l肺癌肺癌：Hiyama等检测了等检测了136例原发肺癌和例原发肺癌和68例癌旁例癌旁非恶性组织，原发

21、癌细胞端粒酶阳性率为非恶性组织，原发癌细胞端粒酶阳性率为80%，正常正常癌旁细胞阳性率为癌旁细胞阳性率为4.4%。端粒酶的活性反映了肺癌细端粒酶的活性反映了肺癌细胞恶变的程度，小细胞肺癌的恶性程度要高于非小细胞恶变的程度，小细胞肺癌的恶性程度要高于非小细胞肺癌，因而端粒酶具有高活性和高检出率。胞肺癌，因而端粒酶具有高活性和高检出率。l肝癌肝癌：Miura检测了检测了12例带有丙肝病毒、例带有丙肝病毒、12例带有例带有乙肝病毒、乙肝病毒、4例未带病毒的肝癌组织及周围慢性肝炎例未带病毒的肝癌组织及周围慢性肝炎和肝硬化组织端粒长度，缩短的程度依次为慢性肝炎、和肝硬化组织端粒长度，缩短的程度依次为慢性

22、肝炎、肝硬化和肝癌细胞。肝癌细胞均有端粒酶活性。肝硬化和肝癌细胞。肝癌细胞均有端粒酶活性。 端粒酶在肿瘤诊断中的应用（端粒酶在肿瘤诊断中的应用（3）l胃癌胃癌：Hiyama等检测了等检测了66例原发胃癌标本，例原发胃癌标本，85%为端粒酶阳性；为端粒酶阳性；15%为阴性，这其中有为阴性，这其中有8例是例是早期患者。癌旁组织端粒酶阳性率为早期患者。癌旁组织端粒酶阳性率为6% l将端粒酶阳性和端粒酶阴性两组相比较，发现：将端粒酶阳性和端粒酶阴性两组相比较，发现：与年龄、性别、组织学、浸润深度无差异与年龄、性别、组织学、浸润深度无差异与瘤体大小，恶性度、有无转移有相关性与瘤体大小，恶性度、有无转移有

23、相关性与生存期有负相关性与生存期有负相关性 端粒酶（端粒酶（-）超过）超过70%， 端粒酶（端粒酶（+）仅为）仅为30%。端粒酶在肿瘤诊断中的应用（端粒酶在肿瘤诊断中的应用（4）l胰腺癌胰腺癌：Hiyama检测检测43例胰腺癌，例胰腺癌，95%有端粒酶有端粒酶活性；活性；11例良性瘤均无活性，例良性瘤均无活性，13例胰腺炎中仅有例胰腺炎中仅有1例例阳性。阳性。l结肠癌结肠癌：Yoshida等检测了等检测了35例结肠癌，例结肠癌，95%（32/35）有端粒酶活性，对应正常组织阴性率为）有端粒酶活性，对应正常组织阴性率为86%（30/35），其余），其余14%为弱阳性；表明端粒酶是为弱阳性；表明端

24、粒酶是良好的肠癌检测指标。良好的肠癌检测指标。 l肾癌肾癌：Mehle等检测了等检测了56例肾癌标本，端粒酶阳性例肾癌标本，端粒酶阳性率为率为71%，对应的正常组织无端粒酶活性。，对应的正常组织无端粒酶活性。端粒酶在肿瘤诊断中的应用（端粒酶在肿瘤诊断中的应用（5）l前列腺癌前列腺癌：Sommerfeld等检测出等检测出21/25例前列腺癌例前列腺癌组织端粒酶为强阳性；组织端粒酶为强阳性；4例淋巴结转移前列腺癌也是例淋巴结转移前列腺癌也是强阳性。正常和良性增生未检出端粒酶活性。强阳性。正常和良性增生未检出端粒酶活性。25例例前列腺癌旁增生组织仅有前列腺癌旁增生组织仅有3例有弱酶活性。端粒酶活例有

25、弱酶活性。端粒酶活性和端粒长度可以作为区别正常、良性增生和恶性性和端粒长度可以作为区别正常、良性增生和恶性前列腺组织的指标。前列腺组织的指标。l膀胱癌：膀胱癌：Yoshida检测了检测了56例膀胱癌，端粒酶阳性例膀胱癌，端粒酶阳性率为率为86%（48/56），），17例非癌膀胱病灶均无酶活性，例非癌膀胱病灶均无酶活性，2例异常发育尿道病灶有端粒酶活性。表明端粒酶活例异常发育尿道病灶有端粒酶活性。表明端粒酶活性可能出现在癌变的早期，有望成为检测早期膀胱性可能出现在癌变的早期，有望成为检测早期膀胱癌的指标。癌的指标。端粒酶与肿瘤治疗（端粒酶与肿瘤治疗（1） 端粒酶存在于许多的癌症组织中端粒酶存在于许多的癌症组织中l抑制端粒酶抑制端粒酶 肿瘤细胞端粒丧失肿瘤细胞端粒丧失 杀死肿瘤细胞杀死肿瘤细胞端粒酶与肿瘤治疗（端粒酶与肿瘤治疗（2）l端粒酶抑制剂治疗肿瘤的特点：端粒酶抑制剂治