第6讲克隆基因检测和鉴定

1、第第6 6讲克隆基因检测和鉴定讲克隆基因检测和鉴定第六讲第六讲 克隆基因的检测与鉴定克隆基因的检测与鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。1. 原理：原理：（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：产生产生 -内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aam

2、picillin）（蓝灰）（蓝灰色）褪色。色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四环素抗，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反

3、而被环丝氨酸杀死。环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄青霉素，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。青霉素指示液选择。 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1. 原理：原理：载体上有一段载体上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）的）的 片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。的插入位点。 受体菌基受体菌基因组中有突变的因组中有

4、突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。片段缺失）。可以被可以被IPTG诱导表达。诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的补形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。假阳性：假阳性： 如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有中止密的倍数并且没有中止密码；（不破坏码；（不破坏 肽）。肽）。 -半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。分解成蓝色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受

5、体菌株转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。的突变型缺陷。一、原理：一、原理：1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型利用有插入片段的

6、重组载体的分子量比野生型载体分子量大。载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较分离质粒，电泳、比较其分子量。其分子量。分子量分子量 Marker载体载体重组克隆重组克隆1. 原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的切这个片断，电泳后比

7、较结果是否符合预计的结果。结果。ABA或或B不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果1. 原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2. 过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1. 核酸杂交核酸杂交一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3. 识别标记识别标记32P 或或 125I 。（1）

8、放射性同位素）放射性同位素2. 检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再（或质粒载体），再用探针杂交。用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直对应的菌斑或噬菌斑位置不变，

9、可以直接找出阳性菌落。接找出阳性菌落。DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时双链变性，复性的时候，候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳双链更稳定。电镜下可见一种定。电镜下可见一种R-环形结构。环形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样品。样品。主要检测插入片断主要检测插入片断是否被转录。是否被转录。从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂，再用探针杂交。交。利用抗

10、体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌并且表来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：质可分为几种作用方式：1. 抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基

11、因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底

12、片曝光发光，底片曝光把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1. 原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2. 方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibod

13、y）: 与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。 酶连（酶连（enzyme-linke）：）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有

14、色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 （1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板（孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶等）。二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应加入无色的底物，

15、被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。转变成有色物质（或发光）。在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。果。有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）临床检验常用的单抗临床检验常用的单抗1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶

16、电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。电荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子的长短），从而把不同分子量的肽链分开。量的肽链分开。电泳电泳buffer电泳电泳

17、buffer点样点样电泳方向电泳方向已知分子量的蛋白质混合已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量为样品蛋白质提供分子量估计。估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位, 等于一等于一氧原子质量的十六分之一。氧原子质量的十六分之一。 一克约为一克约为61023道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出g/带，但可褪色回收。带，但可褪色回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）

18、直接染色直接染色电泳结果直接染色电泳结果电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。膜、中性尼龙膜等）。 Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电场胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正的作用下横向转移到正极一侧的膜上。极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶

19、：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Immuno Blotting多 克 隆 抗 体多 克 隆 抗 体Blotting的结的结果果单抗单抗blotting结结果果一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。翻译

20、成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。否符合预期。适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物分与预期

21、的产物分子量相符？子量相符？mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链后就不能双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链单链mRNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译1. 原理原理1. 原理：原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的的mRNA，进行体外转录。，进行体外转录。 研究其转录产物研究其转录产物的性

22、质是否是预期的基因产物（如分子量、免的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫原性等）。疫原性等）。硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编 码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。特异结合的蛋

23、白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）1. 胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性D

24、HFR氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（中的胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌呤的补救作用次黄嘌呤的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋

25、啉 抑制抑制 抑制抑制 HAT培养基：培养基：Tk- 细胞株。细胞株。TK基因。基因。 宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。（1） 选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原

26、酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存不需要补救！不需要补救！DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。合成四氢叶酸。不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。需要补救！需要补救！dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时

27、，合成受阻时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。生长）。 宿主细胞宿主细胞透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。 无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ 氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作的补救作用，可提高选择。用，可提高选择。DHFR+基因。基因。 载体标记载体标记只有转入只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR

28、-DHFR-DHFR+DHFR+livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。真核生物。（1）选择原理）选择原理 新霉素（新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对真新霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。核细胞和原核细胞都有毒性。 G418（geneticin）细菌的新霉素抗性基因（细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸）编码一种磷酸转移酶（转移酶（APH），能使），能使G418失活。失活。G418真核细胞真核细胞死亡死亡G418存活存活neor真核细胞真核细胞含致死剂量含致