覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案

1、覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案文件审批部 门姓 名签名日期起 草 人质量部XXX年月日审 核 人质量部XXX年月日批 准 人质量部XXX年月日专业资料1、目的本试验对覆盆子鉴别与含量测定检验方法进行确认，为了确保检验数据的科学性、准确性和可靠性， 制定本确认方案， 以确定建立的鉴别与含量测定检验方法能够对该产品进行准确的检验，为我司化验室以后的覆盆子检验方法提供依据。2、范围本方案适用于我公司覆盆子鉴别与含量测定检验方法的确认。3、职责职务岗位姓名职责1.确认方案及报告的审核；确保方案及报告内容符合质量部部GMP 及检测要求。组长XXX2.组织实施确认工作， 确保确认工作严格按照方案实施；

2、长3.确认过程中偏差和变更的审核，组织确认过程中发生的偏差的调查；小组QC 主任XXX负责确认方案及确认报告的起草，确认实施记录的审核成员QCXXX按照确认方案进行确认工作，填写记录，并判定是否符合认可标准要求4、确认依据文件中国药典 2015 年版5、确认程序5.1 先决条件的确认仪器经过校准确认所需仪器经过校准并在有效期内，确认记录见附表01。人员培训确认确认小组人员参加了本方案的培训，以及仪器的操作、 维护和保养培训、 偏差处理、变更控制等SOP 的培训，确认记录见附表02。相关 SOP 的确认制定仪器操作、校验、维护和保养标准程序并批准，确认记录见附表03。药品的确认确认方案确认过程中

3、使用的药品符合规定，并在有效期内。确认记录见附表04。5.2 鉴别方法学确认专属性：专业资料供试品溶液制备取山柰酸 -3-O- 芸香糖苷含量测定项下供试品溶液，即得。对照品溶液制备取椴树苷对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.1mg 的溶液，即得。阴性溶液制备照供试品溶液制备方法除取样品外，同法制成阴性溶液。测定照薄层色谱法标准操作规程试验，吸取上述供试品溶液与阴性溶液各5 l ，及对照品溶液2 l ，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯 -甲醇 -水 -甲酸（90 440.5 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，在105 加热 5 分钟，在紫外光灯（ 365nm ）下检视。

4、供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性液在相应位置上不显斑点（见薄层色谱图05-1 ）。确认记录见附表05。5.3 含量测定方法学确认鞣花酸含量测定检查方法：照高效液相色谱法标准操作规程测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（ 15 85 ）为流动相；检测波长为 254nm 。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于 3000 。对照品溶液的制备取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每 1ml含 5g 的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.5g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇 50m

5、l ，称定重量，加热回流1 小时，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml ，置 5ml 量瓶中，用 70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 l ，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含鞣花酸（C 14H6O 8 ）不得少于 0.20%。系统适用性确认色谱条件高效液相色谱仪XXXXX色谱柱Aglilent TC-C18(2)250*4.6mm5um流速1.0ml/min检测波长254nm ，UV 检测器专业资料柱温25 进样量10 l运行时间30min5.3.1.2.2 溶液配制名称配制

6、方法分别量取乙腈（色谱纯）与超纯水，以乙腈 -0.2%磷酸溶液（15 流动相85 ）的比例混合，用 0.45 m水系微孔滤膜滤过，超声脱气 10min ，即得。必要时可根据实际使用情况调整配制溶液的体积。空白溶剂样品处理用 70%甲醇溶液。取鞣花酸对照品适量，精密称定，加 70%甲醇制成每 1ml 含 5g对照品溶液的溶液，即得。平行制备 2 份，分别为对照品溶液1、2。取本品粉末（过四号筛） 约 0.5g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，称定重量，加热回流 1 小时，放冷，供试品溶液再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 1ml ，

7、置 5ml 量瓶中，用 70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备 2 份，分别为供试品溶液1、2。5.3.1.2.3 试验操作待仪器稳定后， 按下列进样序列注入高效液相色谱仪， 记录色谱图， 以鞣花酸峰面积计算 5 针对照品溶液 1 的 RSD；按外标法以对照品溶液 1 的鞣花酸峰面积计算对照品溶液 2 的回收率。序号样品名称进样体积（ ul ）进样针数1空白溶剂512对照品溶液 1553对照品溶液 252系统适用性回收率按以下公式计算对照品溶液2 的回收率：专业资料RcR21AR21 M R1CR1 100%Rc R22AR22M R1C R1100%AR1 M R2CR2

8、AR1M R2CR2式中：A R1 、A R21、A R22 ：分别为对照品溶液1 连续 5 针的平均峰面积和对照品溶液 2 第一针和第二针的峰面积；M R1、 M R2：分别为对照品1、2 的称样量；C R1 和 C R2：分别为对照品1、 2 中鞣花酸的含量；Rc R21 和 Rc R22：分别为对照品溶液2 第 1 针和第 2 针的回收率；可接受标准5 针对照品溶液 1 鞣花酸主峰的保留时间的 RSD 均不大于 2.0%，鞣花酸主峰面积的 RSD均应不大于 1.0%；对照品溶液 2 的回收率应在 98.0% 102.0% 。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于 3000。注：若系统适用性不符合

9、标准应立即停止进样，排查原因后再重做系统适用性，系统适用性合格后方可进行如下试验。确认记录见附表06。5.3.1.3 含量测定5.3.1.3.1 操作系统适用性合格后，接着系统适用性进样序列取供试品溶液1、2，用 0.45um（尼龙 66）一次性针式过滤头弃去 5ml 后取续滤液，进样，进样序列如下（序号4、5、6）：序号样品名称进样体积（ ul）进样针数1空白溶剂512对照品溶液 1553对照品溶液 2524供试品溶液 1525供试品溶液 2526对照品溶液 152注：在对照品溶液1 运行完成后一般间隔10 针（以时间最短的计）后，应重新插入 2 针对照品溶液1，作为系统跟踪，以此来评价系统

10、稳定性。计算专业资料综合前面 5 针对照品溶液 1 和后面 2 针对照品溶液 1 计算鞣花酸峰面积的RSD，当 RSD 不大于 2.0%时，按以下公式计算覆盆子的含量：供试品峰面积/ 对照品峰面积对照品浓度含量 %100%供试品重量（1水分 %） 稀释倍数注：综合供试品溶液的前面 5 针对照品溶液 1 和后面 2 针对照品溶液 1 计算鞣花酸峰面积的 RSD不符合规定时，应排查原因后，再按项重新测定。可接受标准：按干燥品计算，含鞣花酸（C 14H6O 8 ）不得少于 0.20%。确认记录见附表06 。山柰酸 -3-O- 芸香糖苷含量测定检查方法：照高效液相色谱法标准操作规程测定。色谱条件与系统

11、适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15 85）为流动相；检测波长为 344nm 。理论板数按山柰酸 -3-O- 芸香糖苷峰计算应不低于 3000。对照品溶液的制备取山柰酸 -3-O- 芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成每1ml 含 80 g 的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约1g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，称定重量，加热回流提取1 小时，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml ，蒸干，残渣加水20ml 使溶解，用石油醚振摇提取3 次，每次 20m

12、l ，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取 3 次，每次 20ml ，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 l ，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含山柰酸-3-O- 芸香糖苷（ C 27H30 O 15 ）不得少于 0.03% 。系统适用性确认色谱条件高效液相色谱仪XXX色谱柱Aglilent TC-C18(2)250*4.6mm5um流速1.0ml/min检测波长344nm ，UV 检测器专业资料柱温25 进样量10 l运行时间35min溶液配制名称配制方法分

13、别量取乙腈（色谱纯）与超纯水，以乙腈 -0.2%磷酸溶液（15 流动相85 ）的比例混合，用0.45 m水系微孔滤膜滤过，超声脱气10min ，即得。必要时可根据实际使用情况调整配制溶液的体积。空白溶剂样品处理用 70%甲醇溶液。取山柰酸 -3-O- 芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇对照品溶液分别制成每 1ml 含 80 g 的溶液，即得。平行制备 2 份，分别为对照品溶液1、2。取本品粉末（过四号筛）约1g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，称定重量，加热回流提取 1 小时，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 25

14、ml ，蒸干，残渣加水 20ml 使溶解，用石油醚振供试品溶液摇提取 3 次，每次 20ml ，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取 3 次，每次 20ml ，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备 2 份，分别为供试品溶液1、2。试验操作待仪器稳定后，按下列进样序列注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以山柰酸-3-O- 芸香糖苷峰面积计算5 针对照品溶液 1 的 RSD；按外标法以对照品溶液1 的山柰酸 -3-O- 芸香糖苷峰面积计算对照品溶液2 的回收率。序号样品名称进样体积（ ul ）进样针数1空白溶剂512对照

15、品溶液 1553对照品溶液 252专业资料系统适用性回收率按以下公式计算对照品溶液2 的回收率：RcR21AR21M R1CR1 100%Rc R22AR22M R1C R1100%AR1 M R2CR2AR1M R2CR2式中： A R1 、A R21、A R22 ：分别为对照品溶液 1 连续 5 针的平均峰面积和对照品溶液 2 第一针和第二针的峰面积；M R1、 M R2：分别为对照品1、2 的称样量；C R1 和 C R2：分别为对照品1、 2 中山柰酸 -3-O- 芸香糖苷的含量；Rc R21 和 Rc R22：分别为对照品溶液2 第 1 针和第 2 针的回收率；可接受标准5 针对照品

16、溶液 1 山柰酸 -3-O- 芸香糖苷主峰的保留时间的RSD 均不大于 2.0%，山柰酸 -3-O- 芸香糖苷主峰面积的RSD 均应不大于 1.0%；对照品溶液2 的回收率应在 98.0%102.0% 。理论板数按山柰酸 -3-O- 芸香糖苷峰计算应不低于 3000 。注：若系统适用性不符合标准应立即停止进样， 排查原因后再重做系统适用性， 系统适用性合格后方可进行如下试验。确认记录见附表 07。5.3.2.3 含量测定5.3.2.3.1 操作系统适用性合格后，接着系统适用性进样序列取供试品溶液1、2，用 0.45um（尼龙 66）一次性针式过滤头弃去 5ml 后取续滤液，进样，进样序列如下（

17、序号4、5、6）：序号样品名称进样体积（ ul）进样针数1空白溶剂512对照品溶液 1553对照品溶液 2524供试品溶液 1525供试品溶液 252专业资料6对照品溶液 152注：在对照品溶液1 运行完成后一般间隔10 针（以时间最短的计）后，应重新插入 2 针对照品溶液1，作为系统跟踪，以此来评价系统稳定性。计算综合前面 5 针对照品溶液 1 和后面 2 针对照品溶液 1 计算山柰酸 -3-O- 芸香糖苷峰面积的 RSD，当 RSD 不大于 2.0%时，按以下公式计算覆盆子的含量：供试品峰面积/ 对照品峰面积对照品浓度含量 %100%供试品重量（1水分 %） 稀释倍数注：综合供试品溶液的前

18、面5 针对照品溶液 1 和后面 2 针对照品溶液 1 计算山柰酸-3-O- 芸香糖苷峰面积的 RSD 不符合规定时，应排查原因后，再按项重新测定。可接受标准：按干燥品计算，含山柰酸-3-O- 芸香糖苷（ C 27H30O 15）不得少于 0.03% 。确认记录见附表 07。6、偏差处理在确认过程中， 应严格按照确认方案进行操作和判定，出现个别指标不符合标准的结果时，针对不合格指标应展开调查分析， 对于确认是因操作不当等自身原因造成，应重新进行测试。确认过程中所产生的偏差记录在附表08 中。7、变更控制涉及到方案变更时，填写“变更申请表” ，需要对其进行原因分析，根据分析结果决定是否需要重新制定

19、确认方案还是修改可接受标准， 并将涉及到的变更情况记录在附表 09 中。8、附表清单编号附表名称编号附表名称01仪器校验确认记录表06鞣花酸含量测定方法确认记录表02人员培训确认记录表07山柰酸 -3-O- 芸香糖苷含量测定方法确认记录表03相关 SOP 确认记录表08偏差处理确认记录04药品确认记录09变更控制确认记录5 鉴别方法确认记录表专业资料9、变更记录版本号批准日期变更描述00/新文件。附表 01：仪器校验确认记录表仪器校验确认仪器名称型号检定有效期至检定证书编号符合要求电子天平XXX是 否XXX是 否高效液相色谱仪XXX是 否玻璃仪器校验确认玻璃仪器名称规程编号校正日期符合要求10

20、ml是 否容量瓶25ml是 否50ml是 否100ml是 否是 否是 否移液管10ml是 否50ml是 否是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：所有仪器均经校验且在有效期内。专业资料检查人 / 日期复核人 / 日期附表 02：人员培训确认记录表XXX 电子天平XXX 型高效液覆盆子鉴别与偏差处理变更控制相色谱仪标准培训记录含量测定方法标准操作与维标准管理标准管理操作与维护规学确认方案护规程规程规程程培训时间培训地点课时讲师姓名是否已接受培训（是用“”表示，否用“”表示）是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：执行本方案的

21、人员已得到必要的培训。检查人 / 日期复核人 / 日期专业资料附表 03：相关 SOP 确认记录表SOP 名称检查标准检查结果XXX 电子天平标准操作与维护规程已批准生效是 否XXX 型高效液相色谱仪标准操作与维护规程已批准生效是 否偏差处理标准管理规程已批准生效是 否变更控制标准管理规程已批准生效是 否是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：相关 SOP 均已批准生效。检查人 / 日期复核人 / 日期附表 04: 药品确认记录名称批号来源符合要求覆盆子留样室是 否椴树苷对照品中国食品药品检定研究院是 否鞣花酸对照品中国食品药品检定研究院是 否山柰酸 -3-

22、O- 芸香糖苷对照品中国食品药品检定研究院是 否是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：样品、对照品符合要求。检查人 / 日期复核人 / 日期附表 05: 鉴别方法确认记录人员项目薄层点样温度湿度图谱判定标准结果符专业资料板方式合要求供试品与对照品色谱相专属见应的位置上，显相同颜是市售手动性05-1色的斑点；阴性液不显否斑点。是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：椴树苷鉴别分析方法已确认符合规定。检查人 / 日期复核人 / 日期附表 06: 鞣花酸含量测定方法确认记录色谱柱柱温检测器波长流动相进样量系统适用性确认项目理论

23、板数专业资料对照品 1对照品 2供试品 1供试品 2鞣花酸可接受标准按鞣花酸峰计算应不低于 3000是否符合规定是否是否项目分离度对照品 1对照品 2供试品 1供试品 2鞣花酸可接受标准与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5是否符合规定是否是否项目重复性对照品 1 RSD 值对照品 2 回收率鞣花酸可接受标准5 针峰面积的相对标准偏差（ RSD 值）应不大于2.0%；对照品溶液 2 的回收率应在 98.0% 102.0%是否符合规定是否是否项目保留时间空白溶剂对照品溶液供试品溶液鞣花酸空白溶剂在相应保留时间处没有峰；供试品与对照品在相应保留时可接受标准间处出现峰。是否符合规定是否是否含量测定确认平均峰面积项目对照品 1对照品 2供试品 1供试品 2专业资料鞣花酸含量测定结果供试品 1供试品 2平均值可接受标准：按干燥品计算，含鞣花酸（C 14 H6 O 8）不得少于 0.20% 。是否符合规定是否是否存在偏差或不一致项：是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：。否结论：覆盆子的鞣花酸含量测定分析方法已确认符合规定。检查人 / 日