W135群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫血清IgG抗体亚类和亲合力的检测.docx

1、.论著.W135群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫血清IgG抗体亚类和亲合力的检测袁菲，李献林，王晶，孔素娟，胡浩，罗树权，李燕婷，王欣茹，刘方蕾，沈荣兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室甘雨省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的通过检测W135群脑膜炎球菌结合物(简称W135群结合物)小鼠免疫血清中IgG抗体亚类及IgC抗体亲合力，判断W135群结合物的免疫应答特征。方法免疫血清的制备:将NIH雌性小鼠随机分为3组(A组、B组、对照组)，每组30只。A组采用含2.5多慵的PSW135CNBr.1T分别于0、2、4、8周腹股沟皮下注射小鼠;B组采用含2.5多糖的PSW135CNBr

2、-TT分别于0、4、8周腹股沟皮下注射小鼠;对照组采用含2.5瞄多糖的PSW135分别于0、2、4周腹股沟皮下注射小鼠。分别于每次免疫7d后，经小鼠眼眶静脉采血，分离血清备用；IgG抗体亚类和亲合力的检测:采用间接EUSA分析各组免疫血清中IgG抗体及IgG抗体亚类含量;采用单一浓度的硫象酸钾溶液作为洗脱液,用间接ELISA测定免疫血清中IgG相对亲合力。结果A组和B组获得的小鼠免疫血清,IgG抗体均以IgGl为主(占总IgG抗体的80%以t),IgG抗体及其亚类抗体含最均呈典型的剂次加强效应;对照组各针次免疫血清中的IgC3抗体含量所占比例最高，未见免疫剂次加强效应。A组IgG抗体的相对亲合

3、力分别是46.6%、25.4%、17.6%和47.6%,B组IgG抗体的相对亲合力分别是46.6%.23.6%和48.3%，对照组IgG抗体的相对亲合力分别是92.4%.81.9%和81.0%。结论W135群结合物小鼠免疫血清呈现典型的胸腺依赖性(thymusdependent,TD)抗原的免疫应答特征。关键词:W135群脑膜炎球菌;英膜多糖;免疫血清；IgG抗体亚类;抗体亲合力；胸腺依赖性抗原中图分类号：R392文献标志码：A文章编号：1005-5673(2017)05-0029-05DOI：10.13309/ki.pmi.2017.05.006AnalysisofIgGsubclassan

4、davidityinmouseserumimmunizedbygroupW135meningococcalconjugateYUANFei,1.1Xian-lin,WANGJing,KONGSu-juan,HUHao,LUOShu-quan,LIYaii-ling,WANGXing-ru,LIUFang-lei,SHENRongFirstDepartmentofResearch,LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ud.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,

5、GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor：SHENRong,E-mail:rshen基金项目：甘肃省“十二五陇药产业发展”专项Abstract:ObjectiveToanalyzethelevelsofIgGsubclassantibodiesandtheir'srelativeavidityinmouseserumimmunizedbyusingW135groupofmeningococcalconjugate(simplifiedasPSW135),soastoinvestigatecharacteristicsofim-muno-respons

6、efortheconjugete.Methods，'Preparationofimmuneserum：NIHmicewererandomlydividedinto3groups(groupA,groupB,andcontrol),30mice/group.PSW135CNBr-TTcontained2.5jigpolysaccharidewasinjectedsubcutaneouslyineachmouseat0,2,4,8weeks,forgroupA；PSW135CNBr-ITcontained2.5pugpolysaccharidewasinjectedsubcutaneous

7、lyineachmouseal0,4,8weeksforgroupB；PSW135CNBr-TTcontained2.5眺polysaccharidewasinjectedsubcutaneouslyineachmouseal0,2,4weeks,forcontrol；collectedimmuneserumfordetectioninoneweekaftereachimmunization；IgGantibodysubclassandaffinitydetectionwerecarriedouthyusinganindirectELISA,thelevelsoftheantibodiesin

8、eachgroupwereanalyzed,byusingofpotassiumthiocyanateKSCNaschaotropicagent,therelativeavidityofimmuneserumwasdeterminedbyanelutionofsingleconcentrationofKSCNsolution-indirectELISA.作者简介:袁菲(1982-),女,医学生物学丁程帅主要从事细菌性ResultsIgGlwasthemainantibodycomponentintheimmune多精蛋白结合疫苗的研发工作。serum,accountingtomorethan8

9、0%oftotalIgGantibodiesin通信作者：沈荣，研究员，E-mail:rshengroupAandB,therewereanapparentdoseenhanceeffectinfoursubclasslevelsofIgGantibodies.TherelativeaffinityofIgGantibodieswere46.6%,25.4%,17.6%and47.6%,respectively,forgroupA；46.6%,23.6%and48.3%forgroupB；92.4%,81.9%and81.0%forcontrol.ConclusionTheW135groupo

10、fmeningococcaJconjugatepresentedatypicalcharacteristicsforTD-Ag(thymusdependentantigen).Keywords:MeningococcusgroupW135；Capsularpolysaccharide(PS)；Immuneserum；IgGsubclass；Antibodyavidity；Thymusdependentantigen(TD-Ag)脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitis)，也称脑膜炎球菌(meningococcus),为革兰阴性双球菌，是引起流行性脑膜炎(简称流脑)的主要病原菌。根据

11、荚膜多糖抗原特性将脑膜炎球菌分为12个血清型，有90%的流行性脑脊髓膜炎由A、B、C、W135、Y和X群六种血清型脑膜炎球菌引起。近年来由W135群脑膜炎球菌引发的病例呈上升趋势。0前国内针对W135群脑膜炎球菌的上市疫苗均是多糖疫苗,无法对2岁以下的婴幼儿提供有效保护，多家公司正在积极研发针对W135群脑膜炎球菌的多糖蛋白质结合疫苗，从而给全年龄段人群提供有效的免疫保护。荚膜多糖(capsularpolysaccharide,PS)属于胸腺非依赖性抗原(thymusindependentantigen,以下简称TI抗原)，只能在成熟的B淋巴细胞中诱导产生抗体，产生的抗体没有亚类转换和亲合力成

12、熟的特征，也不产生免疫记忆细胞。由于2岁以下婴幼儿的免疫系统不完善，因此多糖疫苗无法在婴幼儿体内诱导产生有保护水平的免疫应答。多糖与蛋白质结合产生的结合物属于胸腺依赖性抗原(thymusdependentantigen,以下简称TD抗原)，其诱导产生的抗体具有亚类转换、亲合力成熟和免疫记忆的特性，重复免疫具有明显的剂次加强效应，可以在2岁以下的婴幼儿体内产生有保护水平的免疫应答。两种抗原的免疫应答有明显的差异,TI-Ag免疫小鼠后产生的抗体主要以IgM和IgG3为主，TD-Ag免疫小鼠后产生的抗体主要以IgGl为主。试验通过测定W135群脑膜炎球菌结合物(简称W135群结合物)小鼠免疫血清中I

13、gG抗体亚类及IgG抗体亲合力，对W135群结合物的免疫应答特征进行分析,现将结果报告如下。1材料和方法抗原W135群结合物PSW135cnb广TT,由兰州生物制品研究所有限责任公司(简称兰州公司)第一研究室制备，PSW135由兰州公司菌苗一室提供。1.1 实验动物NIH小鼠，SPF级，雌性，体重1214g,由兰州公司实验动物室提供。1.2 主要试剂及仪器漠化氤、己二酸二酰豚(a-dipicdihydr&zide,ADH)、碳二亚胺N-(3-Dimethylaminopropyl)-/V'-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDAC、硫氧酸钾(pot

14、assiumthiocyanate,KSCN)、小牛血清、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin.BSA)、聚氧乙烯月桂醍(Brij-35)、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的羊抗鼠酶标二抗(IgG、IgGl、lgG2a、IgG2b和IgG3)均购自美国Sigma公司产品；磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)由兰州公司第一研究室配制。UV-920AKTAprimeplus层析纯化系统购自美国GE公司；SpectraMAX190酶标仪购自美国MolecularDevices公司；UV-2600紫外可见分光光

15、度计购自岛津企业管理(中国)有限公司；DK-8AD恒温箱购自上海一恒科学仪器有限公司；SepharoseCLVB层析柱购自美国GE公司。1.4免疫血清的制备1.4.1分组及免疫将NIH雌性小鼠随机分为3组(A组、B组、对照组)，每组30只。免疫程序：A组采用含2.5明多糖的PSW135CNBr-TT分别于0周、2周、4周、8周腹股沟皮下注射小鼠；B组采用含2.5jig多糖的PSW135CNBr-TT分别于0周、4周、8周腹股沟皮下注射小鼠;对照组采用含2.5jxg多糖的PSW135分别于0周、2周、4周腹股沟皮下注射小鼠。1.4.2采血分别于每一针次免疫7d后经小鼠眼眶静脉窦采血，分离血清，分

16、装后,将获得的小鼠免疫血清于-70T冰箱保存。1.5IgG抗体亚类的测定采用间接ELISA测定各针次小鼠免疫血清中的IgG抗体以及抗体亚类含量。1.5.1包被抗原的制备漠化策活化、ADH衍生制备PSW135衍生物，然后在EDAC缩合作用下PSW135衍生物与BSA共价结合，经SepharoseCL-4B层析柱层析纯化后制备成PSW135-BSA结合物，经多糖定量后作为ELISA测定小鼠血清抗PSW135抗体的包被抗原。1.5.2 IgG抗体及抗体亚类含量采用间接ELISA测定IgG抗体及抗体亚类含量，以中性PBS为包被溶液，将制备的包被抗原稀释至多糖质量浓度为2jig/mL,加入酶标板，100

17、山丁孔,4无包被过夜;洗板5次，加入含20%小牛血清和0.1%Brij-35的PBS封闭液,200L/孔,4T封闭过夜;封板后-70无保存备用；加入稀释好的小鼠免疫血清（第1针50倍稀释、第2针100倍稀释、第3针200倍稀释），37丁温箱孵育1h；分别加入HRP标记的酶标二抗（抗IgG、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3,5个酶标二抗均是1：400。稀释）,37r恒温箱孵育1h；显色，终止反应后，酶标仪读取A45Onm值。采用四参数法，以W135群脑膜炎球菌免疫血清作为阳性参考免疫血清（阳性参考值设为2000）,测定各组小鼠免疫血清中的IgG抗体及抗体亚类含量。每组小鼠血清IgG抗体

18、水平以几何平均单位（geomeanunit,GMU）表示。1.6IgG抗体的相对亲合力测定根据文献6,采用单一浓度硫氤酸钾溶液洗脱，间接ELISA测定免疫血清中IgG抗体的相对亲合力。1.6.1 KSCN溶液浓度的确定按照1.5.2项操作,将稀释150倍、300倍和450倍的阳性参考免疫血清分别加至酶标板与抗原反应,洗板后，加入倍比稀释的KSCN；对抗原抗体复合物进行解离,25Y孵育15min,酶标板洗5次，终止反应并采集数据。以KSCN的质量浓度为横坐标，彳席顽值下降的比例为纵坐标作图，计算不同稀释倍数的免疫血清的4450nm降至50%左右时所需KSCN的浓度。1.6.2 IgG抗体的相对亲

19、合力按照1.6.1项确定的硫氤酸钾溶液浓度，测定KSCN洗脱后免疫血清中IgG抗体含量。用洗脱前后IgG抗体含量降低的比例来表示抗体的相对亲合力。【gG抗体含量降低的比例越大，说明抗体的相对亲合力越低。1.7统计学分析采用SPSS18.0软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果IgG抗体及抗体亚类的含量如表12所列，A组和B组中，PSW135cnb/IT均可诱导产生高水平的IgG抗体，IgG抗体及其亚类抗体均具有明显的剂次加强效应。适当地延长免疫间隔时间（由2周延长至4周）可提高第2针次的抗体应答水平。A组和B组各针次免疫血清中，IgG抗体均

20、以IgGl为主（占总IgG抗体含量的80%以上）；其余亚类抗体含量从高到低依次为IgG2b>IgG3IgG2a。对照组中，PSW135免疫小鼠后，仅产生低水平的IgG抗体，未见免疫剂次加强效应;各针次免疫血清中的IgG3抗体含量所占比例最高，IgG占总含量的50%左右,IgGl约占35%,IgG2a和IgG2b含最都很低。表1免疫小鼠血清中IgG抗体及抗体亚类含量Tab.1IgGGMUandIgGsubclasslevelsinmouseseraimmunizedbyPSW135CNBr-TT组别免疫针次IgG抗体和抗体亚类含量（GMU）IgGIgGllgG2aIgG2blgC3A110

21、2.9083.802.808.7011.802】427.501290.7067.20132.40104.1034889.504009.70279.80546.80329.80448103.1040308.802068.403852.801703.40B1102.9083.802.808.701J.8023257.132613.5035.73393.80214.10341558.7033581.401728.004236.201731.80对照11.580.530.220.260.75213.174.970.360.376.7839.463.630.230.454.99表2免疫小鼠血清中IgG抗

22、体亚类在IgG抗体中的占比IgG抗体亚类在IgG抗体中所占比例(%)组别免疫针次Tab.2ThepropotionofIgGsubclassantibodylevelsinimmunizedmouseseraA181.442.728.4511.47290.424.719.287.29382.015.7211.186.74483.804.308.103.54B181.442.728.4511.47280.241.1012.096.57380.804.1610.194.41对照133.5413.9216.4647.47237.742.732.8151.48338.372.434.7652.75Ig

23、ClIgG2aIgG2b2.2IgG抗体的相对亲合力测定KSCN溶液浓度的确定如图1所示，不同稀释倍数的阳性参考免疫血清经KSCN洗脱,当4450nm下降至50%左右时,KSCN的浓度均为0.25mol/L,即KSCN洗脱液的最适浓度为0.25mol/Lo图1不同浓度KSCN的44J0(un下降比例Fig.1Thedecreasedproportionof?l4J0omindifferentconcentrationsofKSCNsolutionIgG抗体的相对亲合力如表3所列，A组IgG抗体的相对亲合力分别是46.6%、25.4%、17.6%和47.6%,B组IgG抗体的相对亲合力分别是46

24、.6%.23.6%和48.3%,对照组IgG抗体的相对亲合力分别是92.4%.81.9%和81.0%。A组和B组各针次IgG抗体水平均高于对照组，差异均具有统计学意义(P均=0.000)；A组和B组的第2针次IgG抗体的相对亲合力相近(25.4%VS23.6%)，差异无统计学意义(P>0.05)；但A组第3针次IgG抗体的相对亲合力高于B组第3针(17.6%VS48.3%),差异具有统计学意义(P=0.001)oA组B组两种免疫程序相对亲合力变化趋势一致，免疫血清中高亲合力抗体的比例随着免疫针次的增加而增多，呈现抗体亲合力成熟的特性,延长免疫间隔时间可提高免疫血清中IgG抗体含量，产生的

25、抗体中含有更高比例的低亲合力抗体，使得IgG抗体的相对亲合力降低。表3各组小鼠免疫血清中IgG抗体的相对亲合力Tab.3TheIgGavidityforimmunizedmiceseraineachgroup组别免疫针次相对亲合力A154.90102.9046.621064.801427.5025.434028.204889.5017.6425226.4048103.1047.6B154.90102.9046.622487.703257.1023.6321480.4041558.7048.3对照11.580.1292.4213.172.3881.939.461.8980.0IgG抗体含量(GM

26、U)0.25mol/LKSCN0mol/LKSCN(%)3讨论据文献7报道,TI抗原的抗体应答在个体发育过程中形成的较晚,TI抗原通常无法产生免疫记忆应答，也没有亲合力成熟。相反,TD抗原在个体出生时就能产生免疫应答,并形成免疫记忆细胞，重复接种可产生抗体亲合力成熟。对于TI抗原的免疫应答,即使在二次免疫后也主要以IgG3和IgM为主，而对于TD抗原,随着免疫剂次的增加，IgG的比例逐渐升高,IgGl成为主要的亚类抗体"°】。结果显示,PSW135CNBr-TT采用两种免疫程序产生的IgG抗体均以IgGl为主，占总IgG抗体含晨的80%以上,这与其他文献报道一致"

27、或】；IgG抗体和IgG亚类抗体的含鼠随着免疫剂次的增加均逐渐升高；对照组（PSW135）免疫小鼠后，IgG抗体以IgG3的含量最高，未见免疫剂次加强效应。表明PSW135与TT蛋白质共价结合为PSW135c、b,-TT,即由TI抗原转变为TD抗原。血清抗体亲合力的评价依赖于血清中抗体的均一性,抗体种类越多，抗体亲合力越难准确测定，理想的抗体是均一性非常高的单克隆抗体，因此离液剂被用来离解结合能力弱的抗原抗体复合物，只允许高亲合力的抗体与抗原进行结合,这个反应的基础依赖于打破保持抗原抗体复合物的静电相互作用所需要的硫氤酸盐浓度。试验采用单一浓度的KSCN溶液离解抗原抗体复合物，保留了高亲合力的

28、抗体，用来检测血清中抗体相对亲合力的高低。抗体的亲合力是反应抗体活性的重要指标之一，亲合力的高低反映了抗体中高亲合力IgG抗体的含量。结果显示，两种免疫程序中IgG抗体的相对亲合力随着免疫针次的增加而增加;在免疫后期，延长免疫间隔时间，IgG抗体及各抗体亚类含量均会有明显的升高，但是IgG抗体的相对亲合力反而下降,意味着延长免疫间隔时间,诱导产生的IgG抗体含有较低比例的高亲合力抗体。综上所述，采用两种不同免疫程序，以W135群结合物免疫小鼠后，免疫血清中IgG抗体亚类均以IgGl为主，且IgG抗体的亲合力成熟，免疫应答为典型的TD抗原免疫应答特征。参考文献1MICOUF,ROMANOMR,T

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