第三章紫外可见吸收光谱法

1、仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20121 (Ultraviolet-visible absorption spectromtry, UV-VIS)仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20122 目 录n3-1 概述概述n3-2 化合物电子光谱的产生化合物电子光谱的产生n3-3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计n3-4 误差和测量条件的选择误差和测量条件的选择n3-5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用n3-6 有机化合物结构辅助解析有机化合物结构辅助解析仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20123仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20124 包括比色

2、分析法与分光光度法。比较有色溶液深浅来确定物质含量的方法，属于可见吸收光度法的的范畴使用分光光度计进行吸收光谱分析的方法。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20125波长不同的电磁波，引起人眼的颜色感觉不同。 实验背景实验背景 1666 年，年，英国英国科学家科学家牛顿牛顿第一个揭示了光的色学性质第一个揭示了光的色学性质和颜色的秘密。他用实验说和颜色的秘密。他用实验说明太阳光是各种颜色的混合明太阳光是各种颜色的混合光，并发现光的颜色决定于光，并发现光的颜色决定于光的波长。光的波长。可见光颜色对应的波长物质显色的原因物质显色的原因掌握两个基本概念：复合光，互补色光 比色分析法比色分析法仪器

3、分析塔里木大学 2010塔里木大学 20126溶液的颜色与光吸收的关系溶液的颜色与光吸收的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20127（1）：目视比色法）：目视比色法优点：优点： 1.仪器简单，操作方便，适仪器简单，操作方便，适宜于大批试样的分析。宜于大批试样的分析。 2.测定的灵敏度高，适宜于测定的灵敏度高，适宜于稀溶液中微量物质的测定。稀溶液中微量物质的测定。 3.不需要单色光，可直接在不需要单色光，可直接在白光下进行。白光下进行。 缺点：准确度较差，相对误缺点：准确度较差，相对误差达差达

4、5%-20%仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20128(2) 光电比色法光电比色法测试方法：标准曲线法和标准试样比较法测试方法：标准曲线法和标准试样比较法仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20129 分光光度法：分光光度法： 定量方法和基本原理与光电比色法相同。利用定量方法和基本原理与光电比色法相同。利用单单色器色器来获得所需的单色光。通过调节单色器，即可来获得所需的单色光。通过调节单色器，即可连续地改变单色光的波长。连续地改变单色光的波长。特点：特点： 纯度较高的单色光，准确度较高。纯度较高的单色光，准确度较高。 利用利用吸光度的加和性吸光度的加和性，可以同时测定溶液中两种，可

5、以同时测定溶液中两种或两种以上的组分或两种以上的组分。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201210u远紫外光区：远紫外光区：10-200 nm； u近紫外光区：近紫外光区：200-400 nm；u可见光区：可见光区： 400-780 nm。u仪器较简单，价格较便宜；仪器较简单，价格较便宜；u分析操作简单，速度快；分析操作简单，速度快；u灵敏度高，灵敏度高，10-6g；u准确度、精密度高，准确度、精密度高，1-5%，差示分光光度法；u选择性好，应用广泛。选择性好，应用广泛。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201211n在分子中，除了电子相对于原子核的运动；原子核在在分子中，除了

6、电子相对于原子核的运动；原子核在其平衡位置附近的相对振动；分子本身绕其重心的转其平衡位置附近的相对振动；分子本身绕其重心的转动。动。电磁波吸收与分子能量变化A ：转动能级跃迁（远红外区）B： 转动/振动能级跃迁（近红外区）C：转动/振动/电子能级跃迁（可见、紫外区）仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201212电子能级、振动电子能级、振动能级和转动能级。能级和转动能级。 E分子分子=Ee +Ev +Er。 Ee Ev Er仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201213间的能量差：间的能量差：0.0050.05 eV，跃迁产生吸收跃迁产生吸收光谱位于远红外区（光谱位于远红外区（）；）

7、；的能量差：的能量差：0.051 eV，跃迁产生的吸收光谱跃迁产生的吸收光谱位于红外区（位于红外区（）；）；的能量差较大，约为的能量差较大，约为120 eV。电子跃迁产生电子跃迁产生的吸收光谱在紫外的吸收光谱在紫外-可见光区可见光区()。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201214u电子跃迁可以从基态激发到激发态的任一振动、转动能电子跃迁可以从基态激发到激发态的任一振动、转动能级上。故电子能级跃迁产生的吸收光谱包含了大量谱线级上。故电子能级跃迁产生的吸收光谱包含了大量谱线，并由于这些，并由于这些而成为连续的吸收带。而成为连续的吸收带。u绝大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器绝

8、大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器的的，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201215 当一束光照射到物质上时，光与物质发生相互作用，当一束光照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生于是产生。溶液对光的作用示意图仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201216 当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生原子或离子与光子发生“”。光子的能量被分子、原子。光子的能量被分子、原子所吸收，由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态

9、）。所吸收，由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态）。光子能量的跃迁仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201217hEEE12u分子、原子或离子具有分子、原子或离子具有不连续不连续的量子化能级的量子化能级u不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子化能级不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同，物质对光的吸收具有，其能量差也不相同，物质对光的吸收具有物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201218 将不同波长的光透过某一固定浓度待测溶液，测量每一将不同波长的光透过某一固定浓度待测溶液，测量每一波长下溶液对光的吸收程度，

10、以波长为横坐标，吸光度为纵波长下溶液对光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到吸收曲线坐标作图，即可得到吸收曲线。 。光的吸收曲线仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201219u同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为应的波长称为;u不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max不同不同;不同浓度KMnO4的光的吸收曲线仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012

11、20：由产生谱带的跃迁能级间：由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是，是；。通常将在最大吸收。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数波长处测得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据也作为定性的依据。不同物质的。不同物质的max有时可能相同，但有时可能相同，但max不一定相不一定相同同；仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201221u值得指出的是：值得指出的是：紫外吸收光谱只能作为定性的依据之一，而不能仅根据紫外光谱来定性仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201222Lambert-Beer 定律 入射光的强度为

12、入射光的强度为I0，透过光的强度为，透过光的强度为It，有色溶液的浓，有色溶液的浓度为度为c，液层厚度为，液层厚度为b。朗伯。朗伯-比尔定律比尔定律nk 为吸光系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。其物为吸光系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。其物理意义是：浓度为理意义是：浓度为1g/L,液层厚度为液层厚度为1cm时，在一定波长下时，在一定波长下测得的吸光度。测得的吸光度。 在吸光光度分析中，通常把在吸光光度分析中，通常把 称为透光率，用符号称为透光率，用符号T表示：表示：0lgtIAKcbI0l gl gtIATI0tIII0It思考：偏离朗伯-比尔定律的因素有哪些？仪器分析塔里木大学 2

13、010塔里木大学 2012231. 有机化合物电子跃迁类型有机化合物电子跃迁类型2. 几个概念几个概念. 影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素有机化合物的最大吸收波长计算有机化合物的最大吸收波长计算仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201224 有机化合物有机化合物的紫外的紫外-可见吸收光谱是三种可见吸收光谱是三种电子跃迁电子跃迁的的结果：结果：。np ps sCOHH反键轨道反键轨道 s s*、p p*电子轨道图仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201225 当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态（成键轨道）向激发态（反键轨道）跃迁。主要有四种跃迁。电子能级及

14、电子跃迁示意图仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201226；电子只有吸电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃收远紫外光的能量才能发生跃迁；迁；u饱和烷烃的分子吸收光谱出现饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；在远紫外区；u吸收波长吸收波长200 nm；s sp p *s s *np p E例例：甲烷的：甲烷的max为为125 nm , 乙烷乙烷max为为135 nm。只能被真只能被真空紫外分光光度计检测到；故可作为溶剂使用。空紫外分光光度计检测到；故可作为溶剂使用。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201227u所需能量较大，中等强度吸收；所需能量较大，中等强度吸收；u吸收波长为吸

15、收波长为150250 nm，大部分在远紫外区，近紫外区大部分在远紫外区，近紫外区不易观察到；不易观察到； 600215CH3NH2365258CH3I200173CH3CL150184CH3OH1480167H2Omaxmax（nm）化合物仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201228u所需能量较小；所需能量较小；u吸收波长处于（吸收波长处于（200 nm附近）远紫外区的近紫外附近）远紫外区的近紫外端或近紫外区；端或近紫外区；仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012291.4 n p* 跃迁：跃迁： 发生在近紫外光区和可见光区，它是简单的生色团（见后）如羰基、硝基等中的孤对电子向

16、反键轨道跃迁引起的。 其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201230仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012311. *跃迁：跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷） n * * n *仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012322. 几个概念：4个概念生色团生色团（Chromogenesis group）：）： 分子中含有分子中含有非键或非键或p p键键的电子体系，能吸收的电子体系，能吸收特征特征外来辐外来辐射时并引起射时并引起n-p p*和和p p-p p*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为

17、生色团。构单元，称为生色团。助色团助色团（Auxochromous group） ： 含有含有孤对电子孤对电子，本身不产生吸收峰，但与发色团相连，本身不产生吸收峰，但与发色团相连时，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的时，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。常见助色团助色顺序为：一些官能团，称之为助色团。常见助色团助色顺序为：-F-CH3-Br-OH-OCH3-NH2-NHCH3-NH(CH3)2-NHC6H5-O-仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201233吸收带吸收带 吸收峰在紫外-可见光谱中的波带位置称为吸收带，分为以下四种：R带 属

18、于弱吸收带，溶剂效应比较明显，R带是含杂原子基团的共轭分子的吸收带，如C=O，N=O，N=N等基团，为n*跃迁产生，摩尔吸光系数max100 Lmol-1cm-1，200-400 nm之间；K带（应用最多） 共轭体系的*跃迁所产生的吸收带，如共轭烯烃，烯酮等。K带的吸收强度很高，一般max10000Lmol-1cm-1。跃迁所需能量大，吸收峰通常在217-280 nm。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201234B带 芳香和杂环化合物*的特征吸收带。吸收峰在230-270 nm之间， max100，并出现包含有多重峰或精细结构的宽吸收带（这也是为什么有馒头峰的原因）。这是由于振动跃迁在

19、基态电子跃迁上的叠加。但取代芳香烃的B带精细结构会消失，极性溶剂也会使精细结构消失。E带 含有苯环的物质一般在B带和E带有吸收，也属于芳香结构的特征吸收，由处于环状共轭的三个乙烯键的苯型体系中的*跃迁所产生。E带又分为E1和E2带。E1带出现在185 nm处为强吸收，max10000 Lmol-1cm-1，E2带出现在204 nm处，为较强吸收max1000 Lmol-1cm-1仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201235仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201236u羰基双键与苯环共扼：羰基双键与苯环共扼：K带带强，苯的强，苯的E2带与带与K带合并，带合并，红移；红移；u取代基

20、使取代基使B带简化。带简化。CC H3Onp*，R带pp*，K带仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201237nmax向长波方向移动称为向长波方向移动称为红移红移，向短波方向移动称为，向短波方向移动称为蓝移蓝移 (或紫移或紫移)；n吸收强度即摩尔吸光系数吸收强度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为增大或减小的现象分别称为增增色效应色效应或或减色效应减色效应。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012383.1.3.1.溶剂效应溶剂效应非极性 极性p p*跃迁：红移； ；n p*跃迁：蓝移蓝移； ； 极性溶剂使精细结构极性溶剂使精细结构消失消失；3. 影响紫外影响紫外-可见吸收光谱

21、的因素可见吸收光谱的因素仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201239up pp p* *跃迁基团，大多数激发态的极性比基态强，因跃迁基团，大多数激发态的极性比基态强，因而溶剂极性增大后，而溶剂极性增大后，使激发态能量降低的使激发态能量降低的程度大，从而使基态和激发态的能量差减小，吸收峰程度大，从而使基态和激发态的能量差减小，吸收峰红移，红移，max下降下降；un np p* *跃迁基团，基态时跃迁基团，基态时，使，使n n轨道的能量降低一个氢键的轨道的能量降低一个氢键的能量值，相比之下激发态能量降低较小，因而随溶剂能量值，相比之下激发态能量降低较小，因而随溶剂极性增大，吸收峰蓝移，极性

22、增大，吸收峰蓝移，max升高升高。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201240仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201241u比较未知物与已知物的吸收光谱时，必须采用比较未知物与已知物的吸收光谱时，必须采用相同的溶剂；相同的溶剂；u应尽可能地使用非极性溶剂，以便获得物质吸应尽可能地使用非极性溶剂，以便获得物质吸收光谱的特征精细结构；收光谱的特征精细结构；u所选溶剂在需要测定的波长范围内无吸收或吸所选溶剂在需要测定的波长范围内无吸收或吸收很小。收很小。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201242（a）苯酚的）苯酚的UV光谱图光谱图 （b）苯胺的）苯胺的UV光谱图光谱图 溶液

23、酸碱性对紫外光谱的影响溶液酸碱性对紫外光谱的影响3.2 pH pH值的影响值的影响仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012433.3 助色效应助色效应仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012443.4 共轭效应共轭效应仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012453.5 3.5 立体结构和互变结构对吸收带的影响立体结构和互变结构对吸收带的影响CCHHCCHH顺反异构顺反异构： 顺式：顺式：max=280nm； max=10500反式：反式：max=295.5 nm；max=29000互变异构互变异构： 酮式：酮式：max=204 nm 烯醇式：烯醇式：max=243 nm

24、 H3CCH2CCOEtOOH3CCHCCOEtOHO仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201246 共轭烯烃（不多于四个双键）共轭烯烃（不多于四个双键）p pp p*跃迁吸收峰位置可跃迁吸收峰位置可由由估算估算:165nm217nm p* p p p* p*3 p1p2 p*4 4. 有机化合物的最大吸收波长计算有机化合物的最大吸收波长计算仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201247n无环、非稠环二烯母体：无环、非稠环二烯母体： max=217 nmn异环（稠环）二烯母体：异环（稠环）二烯母体： max=214 nmn同环（非稠环或稠环）二烯母体：同环（非稠环或稠环）二烯母体：

25、 max=253 nmn每增加一个共轭双键：每增加一个共轭双键：+30；n环外双键环外双键 ：+5；n双键上取代基：双键上取代基：n酰基（酰基（-OCOR）：0 n卤素（卤素（-Cl，-Br）：+5n烷基（烷基（-R）： +5 n烷氧基（烷氧基（-OR）： +6 : 由由双键上取代基双键上取代基种类和个数决定的校正项种类和个数决定的校正项CH3CH2CH3-由非环或六元环共轭二烯母体决定的基准值由非环或六元环共轭二烯母体决定的基准值 (以己烷为溶剂）以己烷为溶剂）仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201248母体同环二烯基本值 253 nm烷基取代3 35 nm环外双键 1 5 nmma

26、x计算值=273 nm母体异环二烯基本值 214 nm烷基取代5 55 nm延伸一个共轭双键 30 nm环外双键2 25 nm max计算值=279 nm仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201249仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012503-3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201251紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测光源、单色器、吸收池、检测器器以及数据处理及记录（计算机）等部分组成。双光束分光光度计的原理图双光束分光光度计的原理图一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构可见分光光度计的基本结构仪器分析塔里

27、木大学 2010塔里木大学 2012521. 1. 光源光源光源的作用是提供激发能光源的作用是提供激发能, ,使待测分子产生吸收。使待测分子产生吸收。要求能够提供足够强的连续光谱、有良好的稳定性、较长的要求能够提供足够强的连续光谱、有良好的稳定性、较长的使用寿命使用寿命, ,且辐射能量随波长无明显变化。且辐射能量随波长无明显变化。常用的光源有常用的光源有热辐射光源热辐射光源和和气体放电光源气体放电光源。利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源。如光源。如钨灯、卤钨灯钨灯、卤钨灯。气体放电光源是指在低压直流电条件下气体放电光源是

28、指在低压直流电条件下, ,氢或氘气放电所产氢或氘气放电所产生的连续辐射。生的连续辐射。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012531. 1. 光源光源仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201254氙灯氙灯氘灯氘灯钨灯钨灯仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201255单色器单色器的作用是使光源发出的光变成所需要的单色光。通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、物镜和出射狭缝构成。入射狭缝用于限制杂散光进入单色器，准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件。后者将复合光分解成单色光，然后通过物镜将出自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。出射狭缝用于限制通带宽度。2.2.单色器单色器仪器分

29、析塔里木大学 2010塔里木大学 201256两种不同的单色器两种不同的单色器仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201257u3.3.吸收池吸收池用于盛放试液。石英池用于紫外-可见区的测量，玻璃池只用于可见区。 u4.4.检测器检测器 简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器。目前最常见的检测器是光电倍增管，有的用二极管阵列作为检测器。u光电倍增管在紫外-可见区的灵敏度高，响应快。但强光照射会引起不可逆损害，因此高能量检测不宜，需避光。二极管阵列检测器的特点是响应速度快。但灵敏度不如光电倍增管，因后者具有很高的放大倍数。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201258u单光束仪器

30、中，分光后的单色光直接透过吸收池，交互测定待测池和参比池。这种仪器结构简单，适用于测定特定波长的吸收，进行定量。而双光束仪器中，从光源发出的光经分光后再经扇形旋转镜分成两束，交替通过参比池和样品池，测得的是透过样品溶液和参比溶液的光信号强度之比。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起的误差，并且可以方便地对全波段进行扫描。 u紫外-可见分光光度计有单光束、双光束以及双波长等不同类型的仪器二、仪器的类型二、仪器的类型仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201259双光束双光束仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201260双波长双波长仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20126

31、11.1.波长校正波长校正u可采用辐射光源法校正。常用氢灯(486.13, 656.28 nm)、氘灯(486.00, 656.10 nm)或石英低压汞灯(253.65, 435.88, 546.07 nm)校正。u镨钕玻璃在可见区有特征吸收峰，也可用来校正。 u苯蒸汽在紫外区的特征吸收峰可用于校正。在吸收池内滴一滴液体苯，盖上吸收池盖，待苯挥发后绘制苯蒸汽的吸收光谱。三、分光光度计的校正三、分光光度计的校正仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201262以重铬酸钾水溶液的吸收曲线为标准值校正。将0.0303克重铬酸钾溶于1 升的0.05mol/l 氢氧化钾中，以1cm 吸收池，25C测定

32、吸收光谱。2.2.吸光度校正吸光度校正重铬酸钾溶液的吸光度波长(nm)吸光度透光率(%)波长(nm) 吸光度 透光率(%)波长(nm) 吸光度 透光率(%)2200.44635.83000.14970.93800.93211.72300.17167.43100.04889.53900.69520.22400.29550.73200.06386.44000.39640.22500.49631.93300.14971.04200.12475.12600.63323.33400.31648.34400.05488.22700.74518.03500.55927.64600.01896.02800.7

33、1219.43600.83014.84800.00499.12900.42837.33700.98710.35000.000 100仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201263四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 1.1.分光光度滴定分光光度滴定 以一定的标准溶液滴定待测物溶液，测定滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求得滴定终点，从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012642.2.差示分光光度法差示分光光度法 吸光度A在0.2-0.8范围内误差最小。超出此范围，如高浓度或低浓度溶液，其吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶液，更适合用

34、差示法。一般分光光度测定选用试剂空白或溶液空白作为参比，差示法则选用一已知浓度的溶液作参比。该法的实质是相当于透光率标度放大。四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201265高吸收法高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为100%。 差示分光光度法差示分光光度法四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201266差示分光光度法差示分光光度法四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 低吸收法低吸收法在测定低浓度溶液时使用。选用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作

35、标准溶液，调节透光率为0。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201267差示分光光度法差示分光光度法四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 最精密法最精密法是同时用浓度比待测液浓度稍高或稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节透光率为0或100%。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012683.3.导数分光光度法导数分光光度法 用吸光度对波长求一阶或高阶导数并对波长作图，可以得到导数光谱。四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201269四、分光光度测定方法四、分光光度测定方法 4.4.双波长分光光度法双波长分光光度法 双波长分光光

36、度计是通过两个单色器分别将光源发出的光分成两束单色光，经斩光器并束后交替通过同一吸收池。因此检测的是试样溶液对两波长光吸收后的吸光度差。222111:2:1ssAbCAAbCAAs1和As2为背景吸收，一般只与样品的浑浊程度有关而与波长无关，因此两束光通过吸收池后的吸光度差与待测组分浓度成正比。 bCAAA)(1212仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201270五、双波长分光光度法的特点五、双波长分光光度法的特点 u可用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。可用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。因悬浊液的参比溶液不易配制，使用双波长分光光度法时，可固定波长1为不受待测组分含量影响的

37、等吸收点处，测定波长2处的吸光度变化，可以抵消混浊的干扰，提高测定精度。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201271 无须分离，可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。无须分离，可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。 111222212211212112()()xxyyxxyyxxyyxxyyxxxyyyxyAbCbCAbCbCAAAbCbCbCbCbCbC设有混合组分 和时，时，五、双波长分光光度法的特点五、双波长分光光度法的特点 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201272可测定导数谱。可测定导数谱。 固定波长1和波长2两波长差为1-2nm进行波长扫描，得到一阶导数光

38、谱。有的仪器还带有测定二阶导数光谱的电路。五、双波长分光光度法的特点五、双波长分光光度法的特点 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201273胶束增溶分光光度法胶束增溶分光光度法 胶束增溶分光光度法，是利用表面活性剂胶束的增溶、增敏、增稳、褪色、析相等作用，以提高显色反应的灵敏度、对比度或选择性，改善显色反应条件，并在水相中直接进行光度测量的光度分析方法。简言之，胶束增溶分光光度法是指，表面活性剂的存在提高了分光光度法测定灵敏度的一类方法。六、其它分光光度测定方法六、其它分光光度测定方法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012743-4 误差和测量条件的选择误差和测量条件的选择

39、n一、偏离朗伯一、偏离朗伯-比尔定律的原因比尔定律的原因0.01标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。引起偏比耳定律的偏离。引起偏离的因素：离的因素：仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201275（1）物理性因素 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光。 朗伯朗伯比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导分光光度计只能获

40、得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯致对朗伯比耳定律的正或负偏离。比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯光都会引起对朗伯比耳定律的偏离，比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。的偏离。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201276非单色光作为入射光引起的偏离 假设由波长为假设由波长为1和和2的两单色光的两单色光组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：的溶液，则： A 1lg（o1 /t1 ）1bc A 2lg(o2 /t2 ）2bc故：故：式中：式中：o1、o

41、2分别为分别为1、2 的入射光强度；的入射光强度； t1、t2分别为分别为1、2 的透射光强度；的透射光强度； 1、2分别为分别为1、2的摩尔吸光系数；的摩尔吸光系数；因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A总总，并不能分别测得，并不能分别测得A1和和A2，故，故12112tOtO210;10b cb cIIII仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201277 A总总 lg（o总总/t总总 ) lg(Io1+o2)/(t1+t2） lg(Io1+o2)/(o110-1bc +o210-2bc ）令：令： 2- 1 ；设：设： o1 o2 A总总 lg(2Io1)/t1(110- bc

42、 ） A 1 + lg2 - lgt1(110- bc ) 讨论:仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201278讨论讨论: :A总总 lg(2Io1)/t1(110 - bc ） A 1 + lg2 - lgt1(110- bc )(1) = 0； 即：即： 1= 2 = 则：则： A总 lg（o/t） bc(2) 0 若若 0 ；即；即 20, lg(110 - bc )值随值随c值增大而增大，则标准曲线偏离值增大而增大，则标准曲线偏离直线向直线向c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向轴弯曲，即负偏离；反之，则向A轴弯曲，即正偏轴弯曲，即正偏离。离。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2

43、01279讨论讨论: : A总总 lg(2Io1)/t1(110 - bc ） A 1 + lg2 - lgt1(110- bc ) (3) 很小时，即很小时，即12： 可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使浓度较高，即使 很小，很小， A总总 1 ，且随着，且随着c值增大，值增大， A总总 与与A 1的差异愈大，在图上则表现为的差异愈大，在图上则表现为Ac曲线上部曲线上部(高浓度区高浓度区)弯曲愈严重。弯曲愈严重。故朗伯故朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。 (4) 为克服非单色光引起的偏离，首先应选择

44、比较好的单为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。吸收曲线较平坦处。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201280(2) 化学性因素 朗伯朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；互作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比

45、耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例：例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。对测定有重要影响。仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012811. 1. 分析条件的选择分析

46、条件的选择溶剂溶剂 所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。下表为某些常见溶剂可用于测长区间内吸收小，不易挥发。下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长。定的最短波长。常见溶剂可用于测定的最短波长常见溶剂可用于测定的最短波长可用于测定的最短波长可用于测定的最短波长(nm)常见溶剂常见溶剂200蒸馏水，乙腈，环己烷蒸馏水，乙腈，环己烷220甲醇，乙醇，异丙醇，醚甲醇，乙醇，异丙醇，醚250二氧六环，氯仿，醋酸二氧六环，氯仿，醋酸270N,N-二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸乙酯，四氯化碳，乙酸乙酯，四

47、氯化碳 (275)290苯，甲苯，二甲苯苯，甲苯，二甲苯335丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳(380)二、测量条件的选择二、测量条件的选择 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012822.2. 分析条件的选择分析条件的选择测定浓度测定浓度 溶液吸光度值在0.2-0.8范围内误差小(A=0.434时误差最小)，因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201283 = 0.434 lgT TT作作 - T曲线曲线 CCT=15-65%A=0.2-0.8T=0.368A=0.434A = KC A = K C CC= AA

48、A= - lgT= - 0.434lnTdA =- dT0.434T A =- T0.434T CC= AA光度误差最小光度误差最小控制浓度和调控制浓度和调整比色皿厚度整比色皿厚度 C/C仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201284一般选择最大吸收波长以获得高的灵敏度及测定精度。但一般选择最大吸收波长以获得高的灵敏度及测定精度。但所选择的测定波长下其他组分不应有吸收，否则需选择其所选择的测定波长下其他组分不应有吸收，否则需选择其他吸收峰或采用其它分析方法。他吸收峰或采用其它分析方法。 3. 3. 分析条件的选择分析条件的选择测定波长测定波长 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 20

49、12853-5 紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用 利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系，如有共轭结构体系，如C CC CC CC C、C CC CC CO O、苯环等。、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光并且紫外光谱一般比较简单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的谱可

50、以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201286一、定性、定量分析一、定性、定量分析1.1.定性分析定性分析 max：化合物特性参数，可作为定性依据； 有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性； 计算吸收峰波长，确定共扼体系等 甲苯与乙苯：谱图基本相同； 结构确定的辅助工具； max ， max都相同，可能是一个化合物； 标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图 The sadtler standard spectra ,Ultra

51、violet 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012872. 定量分析 依据：朗伯依据：朗伯-比耳定律比耳定律 吸光度： A= b c 透光度：-lgT = b c 灵敏度高： max：104105 L mol-1 cm -1；（比红外大） 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201288u紫外紫外- -可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%95%的定量的定量分析都用此法。分析都用此法。u其用于定量分析的优点是：其用于定量分析的优点是： 可用于无机及

52、有机体系。可用于无机及有机体系。 一般可检测一般可检测1010-4-4-10-10-5-5 mol/Lmol/L的微量组分，通过某些特殊方法的微量组分，通过某些特殊方法( (如胶束增溶如胶束增溶) )可检测可检测1010-6-6-10-10-7-7 mol/Lmol/L 的组分。的组分。 准确度高，一般相对误差准确度高，一般相对误差1-3%1-3%，有时可降至百分之零点几。，有时可降至百分之零点几。2.1 2.1 单组分定量分析单组分定量分析仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201289配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其

53、吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。求得未知样品的浓度。 2.2 2.2 定量方法定量方法标准曲线法标准曲线法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 2012902.2 2.2 定量方法定量方法标准曲线法标准曲线法 仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201291校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误低于这些点都可能引起计算错误. .注意：注意：仪器分析塔里木大学 2010塔里木大学 201292样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0, C1