水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9: 15051510/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw本研究由国家自然科学基金项目(30170567, 30600345, 30770131, 30771210, 31070278和江苏高校优势学科建设工程项目资助。*通讯作者(Corresponding author: 于恒秀, E-mail: hxyu, T el: 0514-*, Fax: 0514-*第一作者联系方式: E-mail: zygong, Tel

2、: 0514-*, Fax: 0514-*Received(收稿日期: 2011-01-12; Accepted(接受日期: 2011-05-20; Published online(网络出版日期: 2011-06-28. URL: DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01505水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性龚志云 石国新 刘秀秀 裔传灯 于恒秀*扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室 / 教育部植物功能基因组学重点实验室, 江苏扬州 225009摘 要: 无性繁殖是保存非整倍体的一个有效手段。为研究该过程中非整倍体的遗传稳定性, 从水稻第8染色体短臂端三体(2n +

3、·8S自交后代中筛选出相应的端四体(2n +·8S+·8S, 其田间性状表现为植株矮小, 叶片非常窄且内卷, 结实率差。在多年无性繁殖过程中, 该端四体所添加的其中1条·8S 容易丢失使无性系产生性状变异。通过FISH 分析发现该无性变异系的原始株中所添加的2条·8S 具有以下特点: 其中1条·8S 在着丝粒区域检测不到水稻着丝粒的基本组分CentO 序列, 但可以检测到水稻着丝粒的另一基本组分CRR 序列, 该染色体可以稳定遗传; 另外1条·8S 在着丝粒区域同时检测不到CentO 和CRR 序列, 该染色体不能稳定遗传。

4、而在最初保存的相应端三体亲本材料的·8S 中, 同时包含CentO 和CRR 序列。说明·8S 上的CentO 和CRR 在多年的组织培养过程中会随机丢失, 导致含有·8S 的非整倍体在无性繁殖过程中的遗传不稳定性。 关键词: 水稻; 非整倍体; 端着丝粒染色体; CentO; CRRGenetic Stability of Rice Aneuploid during Its Asexual PropagationGONG Zhi-Yun, SHI Guo-Xin, LIU Xiu-Xiu, YI Chuan-Deng, and YU Heng-Xiu *Key

5、Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, ChinaAbstract: Telotetrasome is a kind of aneuploid with two additional identical telocentric chromosomes. To investigate t

6、he genetic stability of rice aneuploid during its asexual propagation, a telotetrasome (2n +·8S+·8S was selected from the progenies of a rice telotrisome (2n +·8S, and preserved by asexual reproduction. But one of the extra short arms (·8S was easy to be lost in the asex-ual prop

7、agation offspring of 2n +·8S+·8S and led to morphological variations. FISH results indicated that one of the two extra ·8S was short of detectable rice centromeric satellite repeat (CentO and centromere-specific retrotransposon (CRR and could not be transmitted stably. The other extra

8、 ·8S contained CRR, but no detectable CentO and could be transmitted steadily. However, the extra ·8S containes the CentO and CRR sequences simultaneously in the initial telotrisomic line (2n+·8S. These results showed that CentO and CRR of the extra ·8S may be randomly lost and l

9、ed inheritance instability in the aneuploid harbouring extra ·8S during asexual propagation.Keywords: Rice; Aneuploid; Telocentric chromosome; CentO; CRR在植物细胞的分裂过程中, 正常染色体的错分裂会形成端着丝粒染色体, 含有该染色体的非整倍体可以用于基因定位、染色体(臂上相关基因的剂量效应分析1-2、细胞分裂过程中染色体行为研究、以及同属不同染色体之间的分化及不同染色体组分化的研究3。但非整倍体一般不能通过有性繁殖稳定保存, 而是通

10、过对非整倍体植株的腋芽进行无性繁殖, 从而在试管中保存非整倍体材料, 是目前植物非整倍体材料保存的主要方法之一4-5。在无性繁殖过程中, 细胞中染色体通过有丝分裂进行传递。其基本元件的完整性是染色体正常传递的关键, 其中着丝粒是真核生物染色体基本元件1506作物学报第37卷之一。每条染色体必须拥有功能性着丝粒, 才能保证染色体在分裂过程中的正常传递, 以维持物种染色体组成的稳定性, 保证无性繁殖过程中上下代之间不发生分离与变异。研究表明在不同物种中, 着丝粒的功能是高度保守的, 但是组成着丝粒的DNA 序列并没有同源性6-8。除发芽酵母的着丝粒由125 bp左右的特异DNA序列构成以外9-11

11、。大多数生物的着丝粒均由高度重复的DNA序列构成, 如裂殖酵母、果蝇、人类、玉米及拟南芥等12-20。在栽培稻中, 着丝粒DNA由串联重复序列(cent- romeric satellite repeat, CentO和着丝粒特异逆转座序列(centromere-specific retrotransposon of rice, CRR组成21, 其中CentO是着丝粒的核心序列, 但在12条非同源染色体上CentO的拷贝数有很大差别。其中, 第8染色体着丝粒区域CentO序列含量最少, 但其着丝粒功能正常。另外, 通过与水稻着丝粒另一重要组分着丝粒特异组蛋白CENH3结合的荧光免疫反应研究表

12、明, 水稻中CENH3含量在每条染色体的着丝粒区域是十分相近的22, 说明不同染色体上功能性着丝粒的DNA结合区域是特定的, 与着丝粒特异DNA序列含量没有必然的联系。本实验室在多年水稻非整倍体研究过程中, 分离并获得第8染色体短臂端四体(T7461。并对其进行无性繁殖保存。但该端四体在田间种植过程中出现性状分离, 细胞学检查表明为其中添加的1条端着丝粒染色体在有丝分裂过程中容易丢失。为了明确该端着丝粒染色体的丢失是否与其着丝粒区域的变异有关, 我们对T7461进行分子细胞学分析, 以探明其端着丝粒染色体在无性繁殖过程中不稳定遗传的细胞学机制。1材料与方法1.1试验材料2004年田间种植水稻品

13、种中籼3037第8染色体的端三体后代, 发现变异株T7461, 20052009年田间种植T7461的无性繁殖后代(试管苗。为便于与原品种比较, 也同时种植了普通中籼3037作对照。所有材料均种植于本校水稻试验农场, 常规水肥管理。1.2染色体的制备取新鲜根尖置2 mmol L1的8-羟基喹啉中, 在20下处理2 h, 然后用甲醇冰醋酸(31的固定液固定; 取合适的幼穗用乙醇冰醋酸(31的固定液固定; 将固定后的材料置20冰箱备用。按Kurata等23的方法进行有丝分裂的染色体制片。按Wu等24的方法进行减数分裂的染色体制片。1.3常规镜检用DAPI染色后在Leica DMRXA荧光显微镜下观

14、察制好的玻片, 对于染色体分散好, 形态清晰的细胞用气冷式数码相机(CCD摄像。1.4荧光原位杂交所用水稻着丝粒特异探针CentO和CRR均由美国Wisconsin-Madison大学Jiming Jiang教授赠予; 端粒DNA探针pAtT4引自美国康奈尔大学; 第8染色体短臂上的特异分子细胞学标记a0005O22和a0070J19来自美国Clemson大学BAC库中心。用digoxigenin-11-dUTP和Biotin-16-dUTP标记探针, 按Jiang等25的方法标记、杂交和检测。1.5杂交后检测与图象处理通过抗地高辛抗体偶联罗丹明偶联物(anti-di- goxigenin-R

15、hodamine或抗生物素抗体偶联FITC偶联物(anti-biotin-FITC检测FISH信号, 染色体用DAPI反染。镜检中获得清晰图像后, 以气冷式数码相机(CCD摄像, 并将图像输入计算机中, 以Leica QFISH软件调节对比度和亮度。2结果与分析2.1 T7461的获得及分子细胞学鉴定T7461是2004年从中籼3037第8染色体短臂端三体(2n+·8S4自交后代中发现的形态变异株。对其鉴定发现每个体细胞中有26条染色体, 比正常中籼3037体细胞染色体多2条, 进一步比较发现, 在每一个细胞的26条染色体中, 有2条长度比正常染色体短(图1-A箭头所示。由于T746

16、1来源于第8染色体短臂的端三体, 所以初步判断其细胞中多出的2条染色体有可能是由第8染色体短臂组成。进一步选用第8染色体短臂的特异分子细胞学标记a0005O22进行FISH分析。由于a0005O22是单拷贝序列, 为了提高检测的灵敏性和准确性26, 我们选择T7461的粗线期染色体进行FISH分析, 并且从同源染色体粗线期配对形成的二价体结构可以确定2个小染色体是否是同一来源。用digoxigenin-11- dUTP标记的a0005O22与T7461粗线期染色体进行原位杂交, 再以anti-digoxigenin-Rhodamine检测, 在荧光显微镜下, digoxigenin-11-dU

17、TP标记的a0052116经anti-digoxigenin-Rhodamine检测之后呈第9期龚志云等: 水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性1507现红色荧光(图1-B, 为此, 在检测中凡是显示有红色杂交信号的即为第8染色体。在T7461细胞中除了正常的1对已联会形成二价体的第8染色体上有红色杂交信号外, 另外还有1个二价体结构上也有红色的杂交信号(图1-B中箭头所示, 与正常的同源染色体联会形成的二价体相比, 这个二价体比较短, 并且配对非常好, 说明它们的确是细胞中的2条小染色体。因此可以确定T7461中添加的2条小染色体的确是来源于第8染色体的短臂, 即T7461是第8染色体短臂

18、的端四体。田间性状表现为植株矮小、叶片非常窄并卷曲, 结实率极差(图2-A。我们对其进行腋芽培养并进行无性繁殖保存。 图1 T7461的FISH分析Fig. 1 FISH analysis of T7461A: T7461体细胞前中期染色体, 红色为端粒信号; B: T7461的粗线期染色体, 红色为a0005O22信号。图中染色体都以DAPI染色, 标尺均为5 m。A: Prometaphase chromosomes of a somatic cell in T7461, the red color denotes the signal of telomere; B: Pachytene

19、stage chromo-somes of T7461, the red color denotes the signal of a0005O22. Chromosomes were counterstained with DAPI in all images. Scalebars: 5 m in two images.2.2 T7461无性变异系的染色体数目及CentO 鉴定20052009年正季将T7461的试管苗移至大田种植。2005年未出现性状分离, 而20062009年均产生性状分离, 出现变异株。对2007年正季种植的20株T7461进行性状调查和染色体数目鉴定, 结果如表1和图2

20、所示。为了叙述方便, 把T7461中未出现变异性状的植株称为原始株; 出现变异性状的植株称为变异株。从表1可知, 在该端四体的无性繁殖后代中80%植株均表现为最初保存的原始株性状, 但同时出现了10%宽窄叶的嵌合株(图2-B以及10%变异株, 变异株叶片的宽度介于正常株与T7461原始株之间(图2-C。原始株染色体数目为2n=26, 细胞中除24条正常染色体外, 另外添加2条较短的染色体。为了明确这2条短染色体是否是端着丝粒染色体, 以Biotin-16-dUTP标记着丝粒特异DNA序列(CentO, 将标记过的CentO与变异株体细胞前中期染色体进行FISH分析。经anti-biotin-F

21、ITC检测杂交信号呈现绿色荧光。在荧光显微镜下, 可以清楚观察到绿色信号位于每条染色体的着丝粒区域(图2-D。但除12对正常染色体有绿色杂交信号外, 原始株中的2条短染色体末端均没有CentO信号(箭头所示。以同样方法对变异株进行FISH分析, 发现变异株染色体数目为2n=25 (图2-E, 其中1条为无CentO信号的短染色体(箭头所示。嵌合体中的宽叶株染色体数目为2n=25, 窄叶株染色体数目为2n=26, 以Biotin-16-dUTP标记的CentO为探针与嵌合体的宽叶株和窄叶株的有丝分裂前中期细胞分别进行FISH分析, 发现嵌合体的窄叶株中较正常水稻多出2条没有CentO的小染色体,

22、 与图2-D中所示相似; 而宽叶株仅多出1条没有CentO的小染色体, 与图2-E中所示相似。2.3 T7461中变异株的CentO和CRR鉴定为了进一步明确T7461中宽叶的变异株及宽窄叶嵌合体中的宽叶株是否是原来的第8染色体短臂端四体丢失了1条·8S, 从而成为第8染色体短臂端三体材料。利用digoxigenin-11-dUTP标记第8染色体短臂上的特异分子细胞学标记B A C克隆a0005O22作为探针, 对T7461变异株的粗线期染色体进行FISH分析, 经anti-digoxigenin-Rhodamine 检测杂交信号呈现红色荧光(图3-A。图中箭头所示的染色体在粗线期发

23、生部分自联, 呈单价体状态。并且有红色杂交信号, 说明该染色体确为第8染色体的短臂。从前面的分析我们已知该染色体不含有水稻着丝粒基本成分之一CentO序列, 为了明确水稻着丝粒另一基本成分CRR是否存在, 同样以表1 T7461无性繁殖后代性状表现与染色体数目鉴定Table 1 Phenotype and chromosome numbers of the asexual propagation offspring of T7461植株Plant植株表型Plant phenotype染色体数目No. of chromosome植株数No. of plant出现频率Frequency (%原始株

24、 Original plant 叶非常窄, 植株矮小Small with very narrow leaves 26 1680 嵌合体 Chimera 宽窄叶的嵌合Chimera of narrow and very narrow leaves 2526 210 变异株 Variant 叶较窄 Narrow leaves 25 2101508作物学报第37卷 图2无性变异系T7461的原始株及变异株的形态及体细胞染色体鉴定Fig. 2 The traits and FISH analysis of the original line and variant of T7461A: 原始株的植株形

25、态; B: 嵌合体植株形态; C: 变异株的植株形态; D: 原始株的有丝分裂中期染色体, 绿色为CentO信号; E: 变异株的有丝分裂中期染色体, 绿色为CentO信号。图中染色体都以DAPI染色, 所有标尺均为5 m。A: Morphology of the original plant; B: Plant morphology of the chimera; C: Plant morphology of the variant; D: Mitotic metaphase chro-mosomes of the original line; E: Mitotic metaphase ch

26、romosomes of the variant. Chromosomes were counterstained with DAPI in all images.Scale bars: 5 m in all images. 图3无性变异系T7461的原始株及变异株的FISH分析Fig. 3 FISH analysis of the original line and variant of T7461 A: 变异株粗线期染色体, 红色为第8染色体短臂上的特异分子细胞学标记(BAC克隆: a0005O22, 绿色为CRR信号; B: 原始株的粗线期染色体, 红色为a0005O22信号, 绿色为C

27、RR信号; C: B图的粗线期染色体二次杂交图, 红色为CentO信号, 绿色为a0005O22信号; D: 原始株的有丝分裂前中期染色体, 红色为CentO信号, 绿色为CRR信号; E: D图的红色CentO信号; F: D 图的绿色CRR信号。图中染色体都以DAPI染色, 所有标尺均为5 m。A: Chromosomes of the variant at pachytene stage, the red signals indicated a specific marker (BAC: a0005022 on the short arm of chromosome 8, the gre

28、en signals were for CRR; B: Chromosomes of the original line at pachytene stage, the red signals were fora0005022 and the green signals were for CRR; C: Secondary hybrid results of chromosomes in pachytene stage of Fig B, the red signals were for CentO, the green signals were for a0005O22; D: Chromo

29、-somes of the original line at mitosis prometaphase, the red signals were for CentO, the green signals were for CRR. E: CentO signals (red of Fig. D. F: the CRR signals (green of Fig. D. Chromosomes were counterstained with DAPI in all images. Scale bars: 5 m inall images. Biotin-16-dUTP标记CRR作为探针与该变

30、异株粗线期染色体进行FISH分析。经anti-biotin-FITC检测杂交信号呈现绿色荧光(图3-A。发现单价体染色体末端有绿色CRR杂交信号(箭头所示。对嵌合体的宽叶株进行同样分析, 获得相似结果。说明T7461原始株在无性繁殖过程中发生体细胞无性系变异, 丢失了端四体中添加的1条·8S, 从而回复成第8染色体短臂的端三体材料。但该端三体材料中仍然保留的·8S在着丝粒区域也发生变异, 因为该端三体材料在最初保存时, 其所添加的·8S着丝粒区域含有CentO4, 但在该回复的端三体中所添加的·8S已不含有CentO, 而只含有CRR序列。2.4T746

31、1中原始株的CentO和CRR鉴定为了进一步分析原始株中容易丢失的·8S着丝粒区域的DNA序列组成, 分别以CRR、第8号染色体短臂特异分子细胞学标记BAC克隆a0005O22和CentO为探针与T7461原始株的粗线期染色体进行FISH分析(图3-B, C。从图3-B可以看出箭头所示的红色a0005O22杂交信号二价体比较短, 说明该端四体中添加的2条·8S发生联会, 并且在二价体末端有绿色的CRR杂交信号, 结合图3-C中箭头所示的染色体进行分析, 表明该二价体的末端没有CentO信号, 有CRR信号。但由于二价体中2个·8S 末端紧密结合在一起, 无法判断是

32、不是2个染色体臂发生断裂的区域都有CRR信号的存在。为了进一步明确CRR在2个·8S上分布情况, 利用CRR和CentO作为探针对T7461原始株体细胞有丝分裂前中期染色体进行FISH分析(图第9期龚志云等: 水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性15093-DF。从图中可以看出箭头所示的2条·8S上都没有CentO的分布, 但CRR在两者末端的分布有差别, 其中白色箭头所示的·8S上有CRR的存在, 而在黄色箭头所示的·8S上没有CRR的存在。结合前面对变异株的分析, 表明既检测不到CentO又检测不到CRR的端着丝粒染色体在无性繁殖过程中是不稳定的,

33、 在少数细胞中会发生丢失, 导致第8染色体端三体的出现。3讨论在体细胞无性系的繁殖过程中, 重复DNA会减少, 在其他研究中也曾报道, 但没有分析重复DNA的类型27-28。在本研究涉及到各类端着丝粒的非整倍体材料中, 没有观察到其他端着丝粒的非整倍体材料染色体臂易丢失的现象, 这可能与体细胞无性系变异过程中仅仅有少量重复序列丢失有关。而第8染色体短臂末端所含有的CentO和CRR最少21, 所以容易完全丢失。但是从T7461中所添加的2个·8S来看, 它们来源于端三体材料中的同一个·8S, 也就是说在最初保存时它们的末端着丝粒是一样的, 都是含有水稻功能性着丝粒基本成分C

34、entO和CRR4。但在长期的无性繁殖过程中其中1条·8S发生了CentO和CRR的丢失, 而另外1条仅发生了CentO的丢失。当染色体发生断裂以后, 2个染色体臂都可能带有原来部分着丝粒的成分, 形成2个新的端着丝粒。并且着丝粒蛋白组分会向周边延伸, 导致着丝粒功能区扩张至着丝粒周围DNA序列。所以染色体断裂能够导致潜在的着丝粒被激活, 成为功能性着丝粒29-30。在本研究中, 当·8S仅发生CentO丢失时, 水稻着丝粒的另一基本组分CRR可以独立充当功能性着丝粒, 保证染色体在分裂过程中的正常传递。说明水稻染色体的着丝粒区域的DNA只要拥有两个基本成分CentO和CR

35、R中的一个, 就能正常传递。但是当CentO和CRR全部丢失后, 可能由另一DNA序列来发挥新着丝粒的功能。但是这段发挥着丝粒功能的DNA序列是不稳定的, 在少数细胞中不能正常传递, 导致·8S的丢失。因而会在第8染色体端四体的材料的无性繁殖后代出现端三体材料, 而导致该无性系田间性状的分离。已有报道表明, 人类染色体的着丝粒基本DNA组成成分-卫星DNA 也会在个别染色体上检测不到, 但该染色体可以传递, 并形成新着丝粒31。由于研究材料的限制, 在人类中无法进行该染色体是否稳定传递的研究。通过本研究, 在水稻中获得了与人类相似的结果, 且水稻材料可以无性繁殖, 便于进一步分析该染

36、色体传递及研究水稻中潜在新着丝粒。4结论在水稻第8染色体短臂端四体(2n+·8S+·8S的无性繁殖后代中出现了宽窄叶分离, 是由于其中的1条·8S端着丝粒染色体丢失造成; 原端四体中的2条·8S端着丝粒染色体中, 1条·8S在着丝粒区域检测不到水稻着丝粒的基本组分CentO序列, 但可以检测到水稻着丝粒的另一基本组分CRR序列, 在无性繁殖过程中该染色体可以稳定遗传; 另外1条·8S在着丝粒区域同时检测不到CentO和CRR序列, 该染色体不能稳定遗传, 容易丢失, 使端四体回复为端三体。而在端四体相应的端三体亲本材料的·8

37、S中, 同时含有CentO和CRR序列。说明·8S上的CentO 和CRR在多年的组织培养过程中会被随机丢失, 导致含有·8S的非整倍体在无性繁殖过程中的遗传不稳定性。References1 Yu W, Han F, Kato A, Birchler J A. Characterization of a maizeisochromosome 8S*8S. Genome, 2006, 49: 7007062 Cheng Z K, Yan H H, Dang B Y. Microdissection and amplifica-tion of the chromosome ar

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