生物化学：第10章 DNA的生物合成

1、第三篇第三篇 基因信息的传递基因信息的传递中心法则中心法则（the central dogma)the central dogma)：指生物体内遗传信息的传递方向指生物体内遗传信息的传递方向复制复制转录转录翻译翻译逆转录逆转录RNA RNA 复制复制DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 十十 章章重点与难点重点与难点: :中心法则、端粒与端粒酶中心法则、端粒与端粒酶DNADNA生物合成的概念与类型生物合成的概念与类型参与参与DNADNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质DNADNA复制的规律、特点和基本过程复制的规律、特点和

2、基本过程逆转录的概念和基本步骤逆转录的概念和基本步骤DNADNA损伤的种类与修复的主要途径损伤的种类与修复的主要途径DNADNA合成合成复制（最主要的复制（最主要的,DNADNA,DNADNA）逆转录（逆转录（RNADNARNADNA）DNADNA的修复的修复DNADNA重组技术重组技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）体内体内体外体外复制复制亲代亲代DNADNA子代子代DNADNA复制复制(replication)(replication)的概念的概念以亲代以亲代DNADNA为模板，按照碱基配对原则合成为模板，按照碱基配对原则合成DNADNA的过程的过程理论基础：理论基础：DNADN

3、A双螺旋结构模型双螺旋结构模型复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA ReplicationBasic Rules of DNA Replication 第一节第一节l 复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l 双向复制双向复制(bidirectional replication)l 半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 一、一、半保留

4、复制半保留复制是是DNADNA复制的基本特征复制的基本特征AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+ 复制时，亲代复制时，亲代DNADNA两条链分开，各自作为模板两条链分开，各自作为模板按碱基配对合成新的互补链，子代按碱基配对合成新的互补链，子代DNADNA与亲代完全与亲代完全相同，且一条链来自亲代，一条链是新合成的。相同，且一条链来自亲代，一条链是新合成的。1.

5、1. 半保留复制的概念半保留复制的概念母链母链DNA 复制过程中形复制过程中形成的复制叉成的复制叉子代子代DNA 亲代亲代 1515N NDNADNA子一代子一代子二代子二代子代子代DNADNA密度梯度实验密度梯度实验2. 2. 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据N N1515-NH-NH4 4ClClN N1414-NH-NH4 4ClCl按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNADNA与亲代与亲代DNADNA的的碱基序列一致，碱基序列一致，即子代保留了亲代即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。3. 3. 半保留复制的意义半保留复

6、制的意义复制起始点及方向复制起始点及方向复制子复制子复制叉复制叉二、二、DNADNA复制从复制从起始点起始点向两个方向延伸向两个方向延伸 形成形成双向复制双向复制复制起始点（复制起始点（origin,Ori)origin,Ori)：是含有是含有100100200200个碱个碱基对的一段基对的一段DNADNA* * 固定的起始点、固定的起始点、双向、等速为主双向、等速为主原核；一个起始点原核；一个起始点 真核：多个起始点真核：多个起始点复制子（复制子（replicon)replicon)复制子：基因组能独立复制的单位复制子：基因组能独立复制的单位原核：整个基因组原核：整个基因组 一个复制子一个复

7、制子真核：真核： 多个复制子多个复制子复制子复制子从一个从一个DNADNA复制起始点复制起始点起始的起始的DNADNA复制区域复制区域复制叉（复制叉（replication forkreplication fork）：）：一个复制子包含二个方向相反的一个复制子包含二个方向相反的复制叉复制叉三、三、DNADNA一股子链复制的方向与解链方向相反一股子链复制的方向与解链方向相反导致导致半不连续复制半不连续复制领头链领头链(leading strand)(leading strand)随从链随从链(lagging strand)(lagging strand)3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解

8、链方向3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 原核：原核：100010002000bp2000bp真核：真核：100100200bp200bpDNADNA聚合酶只能从聚合酶只能从5533聚合聚合岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)(okazaki fragment)顺着解链方向生成的子链，复制是顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行连续进行的，的，这股链称为这股链称为领头链领头链。复制的方向与解链方向相反，复制是复制的方向与解链方向相反，复制是不连续复制不连续复制的，这股链称为的，这股链称为随从链随从链。复制中的不连续片段称为复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazak

9、i (okazaki fragment)fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的复制的半不连续性半不连续性。 DNADNA复制的酶学复制的酶学The Enzymology of DNA ReplicationThe Enzymology of DNA Replication第二节第二节参与参与DNA复制（生物合成）的物质：复制（生物合成）的物质： 模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合底物底物(substra

10、te): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子一、核苷酸之间生成一、核苷酸之间生成磷酸二酯键磷酸二酯键是复制基本化学反应是复制基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 功能（功能（5353聚合功能）聚合功能）底物：底物：dNTPdNTP（N N：A A、T T、C C、G G）模板：模板：DNADNA引物：引物：小片段小片段DNADNA或或RNARNA，带，带33OHOH聚

11、合方向：聚合方向： 5353（ 模板是模板是 35 35 ）聚合反应：反复形成磷酸二酯键聚合反应：反复形成磷酸二酯键全称：依赖全称：依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA (DNA-dependent DNA polymerase,DDDP)polymerase,DDDP)简称：简称： DNA-polDNA-pol pol Ipol IIpol III5 聚合酶活性聚合酶活性+ + 5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+-功能功能修复、切除引修复、切除引物、填补空隙物、填补空隙参与参与DNADNA损伤损伤的应急状态修的应急状态修复复复制延

12、长主要复制延长主要的酶的酶基因突变后的致死性基因突变后的致死性 可能不可能可能1.1.原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 种类种类 核心酶兼有核苷核心酶兼有核苷酸的聚合和核酸酸的聚合和核酸链的链的3 5 外切外切酶活性。酶活性。 亚基起着亚基起着夹住模板链夹住模板链并使酶沿模并使酶沿模板链滑动的板链滑动的作用作用DNA聚合酶聚合酶III ，1010种亚基组成不对种亚基组成不对称二聚体称二聚体(250kD)(250kD) IIIISliding clamp subunitsCatalyticsubunitCatalyticsubunit3 5 exonucleasesubunitsCl

13、amp loader Proposed architecture of DNA polymerase III holoenzyme: an asymmetric dimerNo 5 to 3 exonuclease activity2. 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.0

14、4.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶要求掌握：聚合酶要求掌握：DNA-pol DNA-pol 起始引发，有起始引发，有引物酶引物酶活性。活性。延长子链的主要酶延长子链的主要酶

15、，有解螺旋酶活性。，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起在复制过程中起校读、修复和填补校读、修复和填补缺缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需

16、酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。有方向性的。 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 3 5 5 外切酶活性：外切酶活性： 5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNADNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，

17、并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：l 复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) 严格遵守碱基配对原则严格遵守碱基配对原则 DNADNA聚合酶对碱基的选择功能聚合酶对碱基的选择功能 DNADNA聚合酶的校读功能聚合酶的校读功能 DNA聚合酶的两种酶活性：聚合酶的两种酶活性： 1 1. . 5 53 3 的聚合活性的聚合活性 3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B)稳稳定定已已解解开

18、开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC (dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA (dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质四、复制中解链和四、复制中解链和DNADNA分子的拓扑学变化分子的拓扑学变化（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态1. 1. 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)(helicase)功能：功能：通过

19、水解通过水解ATPATP获得能量来获得能量来解开双螺旋解开双螺旋 -2ATP/-2ATP/一对核苷酸一对核苷酸2. DNA2. DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)(DNA topoisomerase)功能：功能：松弛超螺旋松弛超螺旋1010 8 8 局部解链后局部解链后松弛态松弛态正超螺旋正超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异构酶拓扑异构酶切断切断DNA分子分子两股两股链

20、，断端通过切口旋转使链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负分子进入负超螺旋状态。超螺旋状态。3. 3. 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白（single strand DNA binding protein,SSB)single strand DNA binding protein,SSB)功能：功能： 稳定单链、防止降解稳定单链、防止降解33 T-T-A-C-A-G-C-T-A-G-G-T-CT-T-A-C-A-G-C-T-A-G-G-T-C 5 5 55A-A-U-G-OH 3 A-A-U-G-OH 3 RNA RN

21、A引物引物4. 4. 引物酶引物酶(primase) (primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNA引物的酶。引物的酶。DNADNA复制开始时，需要一个小分子的复制开始时，需要一个小分子的RNARNA片段片段作引物作引物功能：功能：模板：模板：DNADNA底物：四种底物：四种NTPNTP方向：方向：5353引物长短：引物长短： 原核生物原核生物 数十个数十个核苷酸核苷酸 真核生物真核生物 1010核苷酸核苷酸理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶 (gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶

22、酶DnaG (dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC (dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA (dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质DNADNA聚合酶聚合酶：起始、引物酶：起始、引物酶DNADNA聚合酶聚合酶：延伸、解螺旋酶：延伸、解螺旋酶1222222212222222延长酶延长酶起始、引发起始、引发解螺解螺旋酶旋酶拓扑酶拓扑酶DNADNA聚合酶聚合酶/ /转换转换功能：由功能：由ATPATP供能，将缔合供能，将缔合在同一互补链上的两相邻片在同一互补

23、链上的两相邻片段通过磷酸二酯键连接起来段通过磷酸二酯键连接起来五、五、DNADNA连接酶（连接酶（DNA ligase)DNA ligase)DNADNA连接酶在连接酶在复制复制中起最后接合缺口的作用。中起最后接合缺口的作用。在在DNADNA修复修复、重组重组及及剪接剪接中起缝合缺口作用。中起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓

24、扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较引物酶引物酶连接酶连接酶拓扑异构酶拓扑异构酶解螺旋酶解螺旋酶引发体引发体 DNADNA聚合酶聚合酶 SSBSSBDNADNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA ReplicationThe Process of DNA Replication第三节第三节（一）复制的起始（一）复制的起始: :一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成 富含富含ATAT1 1. . DnaADnaA辨认

25、起始点，解螺旋酶解链，提供模板。辨认起始点，解螺旋酶解链，提供模板。辨认起始点辨认起始点解螺解螺旋酶旋酶2. 2. 引物酶合成引物，提供引物酶合成引物，提供3 3 -OH-OH末端。末端。（二）复制的延长（二）复制的延长3535模板模板: :在引物的在引物的3-OH3-OH端，按模板的规定，端，按模板的规定，连续合成领头链连续合成领头链5353模板：模板：不连续不连续合成随从链合成随从链，先合成，先合成冈崎片段冈崎片段3355 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，双向复制的复制片，双向复制的复制片段在复制的终止点段在复制的终止点(ter)(ter)处汇合。处汇合。oriorite

26、rter E.coliE.coli82823232 oriori terterSV40SV4050500 0（三）复制的终止：（三）复制的终止：1. 1. 引物引物RNARNA的切除的切除2. 2. 空缺的填补空缺的填补3. 3. 切口连接：切口连接：DNADNA大分子的形成大分子的形成5 5 5 5 5 5 DNA-pol DNA-pol OHOHP P5 5 DNA-pol DNA-pol dNTPdNTP5 5 5 5 P PATPATP ADP+Pi ADP+Pi5 5 5 5 DNADNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细

27、胞周期DNADNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNADNA生物合成生物合成 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关键点。期这两个关键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。施调控作用。 真核生物每个染色体有真核生物每个染色体有多个起始点多个起始点，是，是多复制多复制子子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是激活而不是同步起动同步起动。 复制的起始需要复制的

28、起始需要DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复参与。还需拓扑酶和复制因子制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似真核真核DNA复制的有关酶类及蛋白因子复制的有关酶类及蛋白因子酶及有关蛋白因子酶及有关蛋白因子功功 能能DNA聚合酶聚合酶/引发酶引发酶引发及后随链的部分合成引发及后随链的部分合成DNA聚合酶聚合酶主要的主要的DNA复制酶复制酶拓扑异构酶拓扑异构酶松弛松弛DNA超螺旋，有利于复制超螺旋，有利于复制解螺旋酶解螺旋酶解开解开D

29、NA双螺旋双螺旋单链单链DNA结合蛋白及复制蛋白结合蛋白及复制蛋白A与单链与单链DNA结合，防止再形成双结合，防止再形成双链链复制因子复制因子C（RFC）参与滑动夹子的装配参与滑动夹子的装配增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）滑动夹，与合成的连续性有关滑动夹，与合成的连续性有关核酸酶核酸酶H（RNaseH）去除去除RNA引物引物盖内切核酸酶盖内切核酸酶I去除去除RNA引物的最后一个核苷酸引物的最后一个核苷酸DNA连接酶连接酶连接冈崎片段及参与修复连接冈崎片段及参与修复 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，性。在复制叉及

30、引物生成后，DNA-pol 通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物的的3 -OH基础上连续合成领头链。随从链引物也基础上连续合成领头链。随从链引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协同，协同，pol 置换置换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 （二）真核生物复制的延长发生（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 真核复制的终止：真核复制的终止：染色体染色体DNADNA呈线状呈线状，复制在末端停止。，复制在末端停止。 复制中冈崎片段的连接，复

31、制子之间的连接。复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体染色体两端两端DNADNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNARNA引物，去除后引物，去除后留下空隙留下空隙。n切除引物的两种机制切除引物的两种机制端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短序列。的短

32、序列。TTTTGGGGTTTTGGGG（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题* * 端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase)端粒酶端粒酶RNARNA端粒端粒DNADNA富含富含T,GT,G端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(telomerase associated protein)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase) n组成：组成：端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶

33、复制子链进一步加工进一步加工端粒、端粒酶与衰老端粒、端粒酶与衰老1.1. 同一种细胞不同生长时期端粒长度不同，且端同一种细胞不同生长时期端粒长度不同，且端粒粒DNADNA序列重复程度与细胞的寿命呈正相关。序列重复程度与细胞的寿命呈正相关。2.2. 细胞每分裂一次，端粒细胞每分裂一次，端粒DNADNA序列丢失约序列丢失约50bp50bp200bp200bp，说明端粒，说明端粒DNADNA序列的缩短与细胞增殖有序列的缩短与细胞增殖有关。随着年龄的增加，细胞的连续分裂，端粒关。随着年龄的增加，细胞的连续分裂，端粒DNADNA逐渐缩短，甚至丢失，细胞老化并丧失增殖逐渐缩短，甚至丢失，细胞老化并丧失增殖

34、能力而死亡。能力而死亡。3.3. 老年人的端粒老年人的端粒DNADNA长度明显短于年轻人。因此，长度明显短于年轻人。因此，端粒端粒DNADNA缩短是细胞衰老的普遍现象。原因可能缩短是细胞衰老的普遍现象。原因可能是人体端粒酶的活性低。研究发现，精子细胞是人体端粒酶的活性低。研究发现，精子细胞和肿瘤细胞中的端粒酶活性极高。和肿瘤细胞中的端粒酶活性极高。逆转录逆转录和其他复制方式和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Reverse Transcription and Other DNA Replication WaysReplication Ways第

35、四节第四节 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录逆转录(reverse transcription)(reverse transcription)概念：概念： 以以RNARNA为模板，在逆转录酶的催化为模板，在逆转录酶的催化下，合成下，合成DNADNA的过程的过程逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) (reverse transcriptase) RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链逆转录酶逆转录酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录酶

36、功能：逆转录酶功能：以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA 核糖核酸酶核糖核酸酶以以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶作为获取基因工程目的转录酶作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称基因的重要方法之一，此法称为为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complemen

37、tary DNA 二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，的重大发现，发展了中心法则发展了中心法则。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究对逆转录病毒的研究(前病毒整合前病毒整合)，拓宽了，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。世纪初已注意到的病毒致癌理论。 n 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、噬菌体三、噬菌体DNA按滚环方式复制和按滚环方式

38、复制和线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 dNTPDNA-pol n D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。 DNADNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) and RepairDNA Damage (Mutation) and Repair第五节第五

39、节遗传物质的结构改变而引起的遗传信遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为息改变，均可称为突变突变(Mutation)(Mutation)。DNADNA突变（突变（DNADNA损伤，损伤，DNA DamageDNA Damage）：）：具体指具体指dNMPdNMP残基以至残基以至DNADNA片段在构成、复片段在构成、复制或者表型功能的异常变化。制或者表型功能的异常变化。 一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病

40、的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础G G二、引发突变的因素二、引发突变的因素 自发因素自发因素 诱发因素诱发因素复制时的碱基错配：复制时的碱基错配： 1010-9-9DNADNA修复和重排中产生的错误：修复和重排中产生的错误：碱基的自发损伤：碱基的自发损伤： 互变异构移位互变异构移位 G-C G-TG-C G-T 脱氨基脱氨基CUCU几百几百/ /每天、每天、AA次黄嘌呤次黄嘌呤 碱基丢失碱基丢失 脱去嘌呤和嘧啶脱去嘌呤和嘧啶细胞内正常代谢产物对细胞内正常代谢产物对DNADNA的损伤：的损伤： 开环、磷酸二酯键断裂开环、磷酸二酯键断裂脱氨基脱氨基不考虑任何因素的影响：不考虑任何因素的影响

41、： 碱基的错配频率碱基的错配频率 1010-1-1-10-10-2-2 但是但是 DNADNA聚合酶双重校正聚合酶双重校正 1010-5-51010-6-6 复制叉复杂结构复制叉复杂结构 1010-7-7-10-10-8-8 修复机制修复机制 1010-9-91010-10-10 诱发因素诱发因素物理因素物理因素 化学因素化学因素紫外线：紫外线： 形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体 TTTT、TCTC、CCCC 引起引起DNADNA蛋白质交联、蛋白质交联、DNADNADNADNA交联交联电离辐射：电离辐射： DNADNA链断裂链断裂 碱基损伤碱基损伤 嘧啶二聚体嘧啶二聚体化学因素化学因素常见的化学诱

42、变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNADNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)(point mutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1 1. . 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2. 2. 颠换颠换（一）错配（一）错配插入插入引起框移