电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析

1、电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析         08-05-09 14:42:00     作者：郝新保，范清宇    编辑：studa20【摘要】  目的 本研究旨在制备骨肉瘤融合细胞瘤苗并检测其体外生物学特性。方法 应用电融合技术制备UMR106细胞与大鼠巨噬细胞的融合细胞，经过磁性分选后，流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量和表面抗原的表达。细胞培养检测融合细胞的克隆形成能力，并体外测定其诱导CTL的杀伤活性。结

2、果 电融合与磁性分选技术相结合可获得95%的融合细胞纯度。流式细胞仪测定表明，融合细胞可表达较高的MHC、类抗原。其软琼脂克隆形成能力明显降低（UMR106,29.2±7.2,融合细胞，17.6±5.1,P0.05）,而诱导CTL细胞杀伤的能力则显著提高（1001时UMR106 13.4±3.2，融合细胞 42.9±7.5,P0.05）。结论 骨肉瘤融合细胞可稳定生长，在体内诱导CTL细胞产生较强的抗肿瘤活性，可用于动物模型以检测其所诱导的抗骨肉瘤效果。 【关键词】  骨肉瘤瘤苗细胞融合Characterization of  Ost

3、eosarcoma  Vaccine  Cells  Prepared  by  Electrical  Cell  FusionAbstract：Objective   Prepare  the  osteosarcoma  vaccine by cell fusion and  detect  itsbiological properties.Methods  The  osteosarcoma  vaccine 

4、; was  obtained  by  fusing  UMR106  and  rat  macrophages  with  electorporator.The  DNA  and  surface  antigen  expression  of  fusion cells  purified  by  magnetic  cell  sorting  unit

5、60; were  assayed  with  flowcytometry.The  colony  assay  of  the  cells  and  the  analysis of  CTL  activity  induced  by  fusion  cells  in vivo  were  also  performed.Results  The highe

6、r  cell  fusion  efficiency  can  be obtained  with  electroporator  and   about  95%  purity of  fusion  cells  achieved  by  magnetic  cells  sorting  unit. The  fused  osteosarcoma 

7、cells  expressed  more  MCH、 and formed  less  colony  on  soft  arga.Those  cell  intensively  induced  the  CTL  activity  against  wild  UMR106 cells  as  well.Conclusion  The proliferation  o

8、f  fused  osteosarcoma  cells  was  stable  and  the  high  level  CTL  activity  was   induced  by  them.The  cells  can  be used  as  vaccine  in  osteosarcoma  treatment  e

9、valuation  on  animal  models.Key words：Osteosarcoma; Tumor  vaccine; Cell  fusion0  引言    复发和肺转移是威胁骨肉瘤患者生命的主要矛盾1,为此，有必要探讨主动性免疫治疗在骨肉瘤患者中应用的可能性。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的治疗途径值得探讨2。    本研究应用电融合技术制备骨肉瘤与抗原提呈细胞（主要是巨噬细胞，树突状细胞研究另

10、文报告）的融合细胞，并对其相关的免疫学特性加以研究，为其作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤患者的治疗提供理论指导。1  材料和方法1.1  实验材料及仪器    大鼠骨肉瘤细胞系UMR106购自美国ATCC（American  Tissue Culture Collection）;大鼠MHC、单抗，大鼠巨噬细胞CD68单抗，羊抗小鼠IgGFITC均为英国SEROTEC公司出品；RPMI1640培养基和胎牛血清为Invitrogen公司生产，3HTdR为上海原子能研究所产品。SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心，雄性个体5只，平均体重136克。E

11、CM2001型细胞融合仪购自美国BTX公司；MACS磁分选仪和试剂盒由德国Miltenyi  Biotec  GmbH生产。1.2  细胞培养    肿瘤细胞和融合细胞均培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，0.25%胰蛋白酶消化传代。1.3  巨噬细胞分离    拉颈处死成年SD大鼠，全身70%乙醇灭菌后在超净台中剪开腹腔，用滴管加入10ml RPMI1640不完全培养基灌洗，小心吸出培养基1 000r/min,离心5min收集巨噬细胞，培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养

12、基中。1.4  细胞融合    应用细胞融合仪按15融合巨噬细胞和UMR106细胞。使用3.2mm融合电极，AC为30 V 10s;DC为640 V  30s;2个脉冲。其他操作参见仪器说明书。1.5  融合细胞的筛选和分离效果检测    应用MACS磁性分选仪和MS+分选柱，按CD68单抗分选试剂盒使用说明操作，分离出CD68+细胞。分选出的细胞做连续传代排除未融合的巨噬细胞，获得相对较纯的融合细胞（MUFs）。    将上柱前的细胞、CD68结合细胞和未结合细胞各1

13、15;105个，用PBS洗1次并悬浮在80l  PBS中，加入20l  FITC标记的羊抗鼠IgG,孵育10min后PBS洗2次，在400倍荧光显微镜共计数200个细胞（四个视野），根据公式计算回收率和纯度3。    回收率=100×(N1×P1)/(N0×P0),其中N1为洗脱段的细胞数，P1为洗脱段阳性细胞百分率，N0为上柱前细胞总数，P0为上柱前阳性细胞百分率。1.6  DNA含量测定和染色体计数    1×105个融合细胞悬浮在200l  

14、; PBS中加EB染色10min,流式细胞仪测定细胞DNA含量。培养的融合细胞生长至80%满时加秋水仙碱到终浓度为0.25g/ml处理3h,胰酶消化后加0.075mol/L  KCL低渗处理细胞25min,然后用甲醇/冰醋酸（31）固定2次，制片后染色拍照。1.7  细胞表面抗原的表达    1×105融合细胞悬浮在80l   PBS中，分别加入MHC、和CD68各20l ，4孵育10min,PBS洗2次，加入FITC标记的二抗20l，4孵育10min,PBS洗2次，重悬在200l   PBS中

15、上流式细胞仪检测。1.8  克隆形成率和软琼脂克隆形成能力    按300/孔把融合细胞接种在24孔板中，10天后计数已形成的克隆数，大于30个细胞的集落算1个克隆。按公式计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数/接种细胞数。    将0.6%底层琼脂加入24孔板中，每孔1ml，待其凝固后调整细胞浓度2×103/ml，并在37与0.4%琼脂混合，按每孔500个细胞的量加到底层琼脂上，37培养2周后计数克隆数。1.9  体内诱导杀伤性T淋巴细胞的能力    分别用融合细胞和UMR106细胞接种SD大鼠，2周后取脾。制备脾细胞悬液，加0.83%氯化铵去除红细胞，然后用尼龙毛柱去除B淋巴细胞。与免疫大鼠时相对应，在2×106个T淋巴细胞中分别