结核菌药物敏感性测定

1、结核菌药物敏感性测定标准化操作及质量保证手册国家结核病参比实验室2010年3月前言 结核病细菌学检查是结核病控制规划重要的组成部分，随着现代结核病控制策略（DOTS）在我国的广泛实施，以及结核病控制三大目标的全面实现，结核病防治政策与技术策略有了很大的发展，在继续扩展高质量的DOTS的基础上，积极应对耐多药肺结核（MDR-TB）、结核菌/艾滋病病毒（TB/HIV）和其他挑战。为满足当前结核病防治工作的需要，结核病实验室的工作任务也从之前的以痰涂片镜检发现传染性肺结核病人为重点，扩展到细菌学诊断、耐药结核病诊断等更加广泛的服务领域。结核分枝杆菌药物敏感性测定（简称）是耐（多）药结核病防治中必不可

2、少的重要工具，其主要作用是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。目前耐多药结核病规划性管理（PMDRTB）已在我国部分地区开展了试点，并将以较快的速度在全国扩展。但在我国公共卫生领域，分枝杆菌药敏试验开展得并不普遍，大部分结核病防治机构的结核病实验室没有相应的经验和技术，缺乏系统的标准化文件，存在标准不一致、操作不规范、质量良莠不齐的问题。为进一步规范药敏试验的操作，保证工作质量和试验人员安全，国家结核病参比实验室与世界卫生组织合作，编制了本册结核分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作手册，详细描述结核菌药敏试验各个过程的操作程序。目前世界卫

3、生组织推荐的药敏试验方法包括比例法、绝对浓度法和液体培养法。其中比例法为目前我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法，将在本手册中重点介绍。绝对浓度法是我国三十多年沿用的药敏试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法，本手册也有独立章节进行描述，方法引自中国防痨协会结核病诊断实验室检验规程。本手册参考世界卫生组织系列的结核病实验室标准化操作程序（SOP）的主要框架和内容，按照我国结核病规划的实际情况和具体要求进行了调整，并通过在部分省份的试点进一步进行了修改和完善，使之更具有可操作性，供开展药敏试验的实验室使用。梅里埃基金会和第七轮全球基金结核病项目为本

4、手册的制定和修订提供了支持,世界卫生组织驻华代表处为本手册试点提供了支持，江苏省、辽宁省部分实验室为本手册提供了修改意见。编者 2010年3月目 录概述5图1 比例法间接法操作流程图6图2 绝对浓度法间接法操作流程图6第一章 药敏试验的基本要求7第一节 实验室设计和环境安全7第二节 实验室设备及耗材7第三节 实验室管理8第四节 个人防护操作程序9第二章 比例法药敏试验标准化操作程序16第一节 培养基的制备16第二节 药敏试验菌株的准备19第三节 菌液的制备21第四节 接种22第五节 培养23第六节 结果的判读和解释23第七节废弃物处理26第八节 菌株的短时保存和运送26第三章 绝对浓度法药敏试

5、验标准化操作程序28第一节 培养基的制备28第二节 药敏试验菌株的准备29第三节 菌液的制备29第四节 接种29第五节 培养30第六节 结果的判读和解释30第七节 废弃物处理31第八节 菌株的短时保存和运送31第四章 药敏试验质量保证33第一节 实验室网络及职能33第二节 室内质量控制34第二节 室间质量评估37一、现场评价37二、药敏试验复检38三、熟练度测试40第五章、仪器的使用和维护43第一节 生物安全柜43一、简述43二、安装43三、使用43四、安全注意事项44五、甲醛熏蒸消毒44第二节 恒温培养箱44一、简述44二、采购与安装45三、使用步骤和注意事项45四、质量控制和温度监测45五

6、、校正45六、维护45第三节 蒸汽凝固器46一、基本要求46二、使用步骤46三、清洁46四、注意事项46第四节 天平46一、基本要求46二、操作程序47三、维护47第五节 高压灭菌器48一、简述48二、定义和缩写48三、应用范围48四、安装48五、适宜高压灭菌的物品49六、指示试剂49七、个人资质49八、操作程序49参考文献52附件53附件1 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定53附件2 人间传染的病原微生物名录（节选）57概述 无论是对临床个体诊断还是对流行病学调查和监测，标准可信的药敏试验方法都是至关重要的。目前结核病实验室常用的细菌学药敏试验方法包括比例法和绝对浓

7、度法，分别由法国的G.canetti、J.Grossete 和德国科学家G.Meissner于上世纪六十年代首先提出。虽然药敏试验是有着近半个世纪历史的比较成熟的技术，也是结核病细菌学实验室的常规工作，但操作较为复杂、影响因素较多。从实验室操作角度讲，比例法与绝对浓度法并无很大差别（见比例法操作流程、绝对浓度法操作流程），但由于比例法是通过计算耐药菌比例来解释结果的，对药敏试验中的重要变异因素接种量进行了一定程度的校正，故结果较之绝对浓度法更为稳定。无论比例法还是绝对浓度法，都可以使用直接法和间接法的药敏试验。直接法是指将临床标本进行前处理后，根据涂片镜检的菌量进行稀释，再直接接种到对照和含药

8、培养基上的药敏试验方法，它适用于经显微镜验证含菌量较多的标本。而间接法则是首先对临床标本进行分离培养，待得到肉眼可见的细菌纯培养物后再进行药敏试验。直接法的优点是分离培养和药敏试验同时进行，可以比间接法提前3-4周报告结果，缺点是接种量不易量化、难以控制污染。与之相反，间接法报告结果较慢，但基于纯培养物的操作相对容易控制菌量、结果比较准确污染率较低。 在中国结核病防治规划实施工作指南（2008）中，推荐的药敏试验方法为比例法间接法。本手册主要介绍比例法间接法、绝对浓度法间接法的标准化操作程序，包括培养基制备、菌株的传代和准备、菌液的制备、接种、培养、结果的判读和解释、结果记录和报告、污染物的处

9、理、菌株的保存和运输以及有关仪器设备的使用和维护。图1 比例法间接法操作流程图出现肉眼可见菌落后12周的新鲜菌落磨菌制备成1mg/ml的菌悬液无药对照培养基稀释100倍接种0.01ml稀释成102mg/ml的菌悬液稀释100倍接种0.01ml含药培养基稀释成104mg/ml的菌悬液图2 绝对浓度法间接法操作流程图出现肉眼可见菌落后12周的新鲜菌落磨菌制备成1mg/ml的菌悬液稀释10倍无药对照培养基稀释成101mg/ml的菌悬液稀释10倍含药培养基接种0.1ml稀释成102mg/ml的菌悬液第一章 药敏试验的基本要求根据我国病原微生物实验室生物安全管理条例、实验室生物安全通用要求、人间传染的病

10、原微生物名录和医疗机构临床实验室管理办法的规定，结核分枝杆菌药物敏感性试验应在符合生物安全二级（Biosafety Level 2，BSL-2）或二级以上环境中进行。实验室所用设施、设备和材料（含防护屏障）均应符合国家相关的标准和要求。生物安全实验室必须符合以下三个基本原则：（1）实验室的设计及工程施工必须合理；（2）需配备相应的安全设备；（3）制定实验室管理制度和规范的操作程序。第一节 实验室设计和环境安全必须满足国家生物安全二级（BSL-2）实验室标准的要求,主要包括：1. 实验室门应为外开门，应带锁并可自动关闭，实验室的门应有可视窗；2. 在实验室门上应该标有国际通用的生物危害警告标志；

11、3. 实验室墙壁、天花板和地板易清洁、不渗液以及耐化学品和消毒剂的腐蚀，地面应防滑；4. 实验操作台面应能耐热防水，耐消毒剂、酸、碱和有机溶剂的腐蚀；5. 在实验室内部，有在黑暗中可明确辨认的出口指示标识；6. 应有足够的存储空间摆放物品以方便使用，在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。7. 应设洗眼设施或设备，必要时应有应急喷淋装置；8. 有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全操作柜、冰箱等应设备用电源；第二节 实验室设备及耗材实验室内至少应配备二级生物安全操作柜、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、环形加热炉、涡旋振荡器、普通冰箱；如果自制培养基还需要蒸汽凝固灭菌

12、器、蒸馏水制备装置或去离子水制备装置；使用和维护方法详见本手册第五章。药敏试验所需耗材为培养基、试管架、烧杯、量桶、移液管、接种环、废液缸。第三节 实验室管理一、组织机构与制度管理1. 实验室所在单位应成立实验室生物安全委员会，法人代表必须为生物安全委员会负责人，实验室负责人必须是生物安全委员会成员。2. 根据本实验室的工作需要、实验室工作类型以及本地的情况，生物安全委员会制定完整的安全政策、安全手册、以及执行安全手册的支持程序、定意外事故处理方案等，并监督实施；3. 实验室应设专人负责实验室安全；4. 实验室中管理制度必须包括准入制度、个人防护制度、标本接收制度、废弃物处理制度、意外事故处理

13、预案、生物安全培训制度、生物安全自查制度、废弃物处理制度、仪器维护维修制度；二、培训与健康监测（一）实验员应接受实验室生物安全培训，至少包括；1. 健康潜在危险（结核症状和传播）。2. 小心尽量减少气溶胶的产生，预防暴露。3. 健康要求。4. 佩戴使用保护性设备和衣服。5. 处理潜在的感染性物质。6. 如何预防事故（生物的、化学的、电、火）发生，发生事故要采取的措施。7. 良好的实验室操作程序。（二）培训应该：1. 在工作开始前时。2. 严格监督。3. 在工作条件改变时。4. 定期复训。学员应该给予证书证明他们对于培训的理解和培训的操作正确。（三）健康监测依据国家法律法规，应该在以下情况下安排

14、结核实验室工作人员进行相关健康监测，并保存监测结果备查：1. 招聘进入结核实验室前。2. 上岗后定期健康监测。3. 任何危险事故后。4. 一旦有结核症状时。个人的健康记录应该在职业暴露后保存至少10年，根据国家的法律法规。5. 工作人员应该被告知结核的症状，并且一旦出现症状应该能够提供便捷的免费就医条件。6. 根据国家法律法规判定的由于职业暴露于危险物质的疾病或者死亡应该报告给主管机构。三、实验室操作1. 实验室应制定各种试验操作和仪器设备操作的标准化操作程序；2. 实验员必须接受相关专业知识和操作技能的培训，方能进行试验操作；3. 受过相关培训的实验员操作时，必须符合标准化操作程序；4. 负

15、责生物安全管理的人员，有责任制止不规范操作，以及处理意外事故。5. 严格按照有关规定进行废弃物处理。四、菌种或样本运输安全管理为保障人体健康和公共卫生安全，在运输可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理，具体见附件。第四节 个人防护操作程序结核菌培养属于进行分离高致病性病原微生物的操作，实验室实验人员进入培养试验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、帽子、防护面罩（N95口罩或过滤式呼吸器）。针对呼吸道传播的传染病，按照带双层手套的条件下，个人防护物品穿戴顺序：口罩、帽子、防护服

16、、护目镜、鞋套、双层手套；脱下顺序为：外层手套、护目镜、防护服、内层手套、帽子、鞋套、口罩7。一、防护服根据制作材质的不同，防护服可分为一次性防护服和再重复使用的布制防护服，防护服应为联体式或背开式，袖口应为紧袖。如果是短时参观而不进行操作，按照如下进行穿脱防护装备，出实验室前洗手。如果进行试验操作而且防护服为背开式，防护服内应穿长袖隔离衣。（一）布制防护服衣穿脱标准程序1穿重复使用布制防护服：（1）右手提衣领，左手伸入袖内，右手将衣领向上拉，使左手露出。（2）换左手持衣领，右手伸入袖内，使右手露出。（3）两手持衣领，由领子中央顺着边缘向后系好颈带。（4）再扎好袖口。（5）将隔离衣一边（约在腰

17、下5cm）处渐向前拉，见到边缘捏住。（6）同法捏住另一侧边缘。（7）双手在背后将衣边对齐。（8）向一侧折叠，一手按住折叠处，另一手将腰带拉至背后折叠处。（9）将腰带在背后交叉，回到前面将带子系好。2脱重复使用布制防护服：（1）解开腰带，在前面打一活结。（2）解开两侧袖带，将袖带塞入袖袢内，充分暴露双手，进行手消毒。（3）解开颈后带子。（4）右手伸入左手腕部套袖内，拉下袖子过手。（5）用遮盖着的左手握住右手隔离衣袖子的外面，将右侧袖子拉下。（6）双手转换渐从袖管中退出，脱下隔离衣。（7）左手握住领子，右手将隔离衣两边对齐，若挂在污染区，污染面向外，否则污染面向里。（二）一次性防护服穿脱标准程序1

18、穿一次性防护服无论是联体还是分体防护服，先穿下衣，再穿上衣，然后戴好帽子，最后拉上拉锁。2脱一次性防护服（1）脱分体防护服时应先将拉链拉开。向上提拉帽子，使头部脱离帽子。脱袖子，脱下上衣将污染面向里放入医疗废物袋。脱下衣，由上向下边脱边卷，污染面向里，脱下后放入医疗废物袋。（2）脱联体防护服时，先将拉链拉到底。向上提拉帽子，使头部脱离帽子，脱袖子。从上向下边脱边卷。脱下衣，将污染面向里脱下后放入医疗废物袋内。（三）注意事项1穿防护服之前要检查防护服有无破损。2穿防护服后只限在规定区域内进行操作活动。3穿着防护服时勿使衣袖触及面部及衣领。4防护服有破损应立即更换。5脱防护服时要注意避免污染。二、

19、鞋套/工作鞋对于进行操作的实验员，应配备实验区内用的鞋；短时参观人员需要进入污染区，应穿鞋套。1鞋套的作用：防止鞋、袜受到样本污染。防止污染清洁环境。2鞋套的选择要求：鞋套应具有良好的防水性能，并一次性应用。3鞋套的应用范围：从清洁区进入污染区时。4鞋套只在规定区域内穿，离开该区域时应将鞋套脱掉。5鞋套如有破损时应及时更换。三、呼吸防护用具针对结核病实验室应用的有效呼吸防护面罩，包括过滤式呼吸器和生物安全口罩。过滤式呼吸器特点是不需要做适合度测试（fit test），可以长时间反复使用（使用时间根据使用环境不同而不同），穿戴比生物安全口罩舒适，但价格较高。生物安全口罩但需要进行适合度测试，佩戴

20、时口罩固定带对面部压迫力度较大，实验员较长时间佩戴会感到不适；生物安全口罩不能长时间使用，而且长时期使用其总的成本并不低。但由于生物安全口罩的一次性价格较低，所以应用较多，本手册主要介绍生物安全口罩,如果条件允许，也可以使用过滤式呼吸器。¡ 生物安全口罩有很多种，目前应用最多的是N95口罩。N95口罩是美国国家职业安全卫生研究所(NIOSH)认证的医用防护口罩。“N”的意思是指非油性的颗粒物，“95”是指在NIOSH标准规定检测条件下，截获率达到95%，要选择适合自己脸型的口罩，才能有较好的密合性,从而保证佩戴人员的呼吸安全。只有获得NIOSH认证的呼吸器才能标注NIOSH N95，

21、单独标注N95说明没有获得NIOSH认证（一）NIOSH N95口罩穿戴方法：1、 将口罩外部朝向掌心放置在手上，口罩鼻片部份朝向指尖，单手手指穿过固定带；2、 将口罩罩在面部；3、 另一只手将上方固定带越过头顶，使其固定于头部上方；4、 将下方固定带越过头顶，固定于两耳下之颈后位置；5、 使用双手压紧鼻片两侧，使与鼻部契合；6、 以双手掌杯形覆盖在口罩上并用力呼气，如果密合不好，会有空气沿着边缘（鼻侧等处）泄漏；7、 如果呼气时空气由鼻侧逸出，请重复步骤5；如仍有空气由口罩四周逸出，应调整固定带位置后，重新检查或更换适合个人脸型之口罩；8、 避免固定带压迫耳朵；9、 当口罩有破损或扭曲、或不

22、能维持较贴和的脸部佩戴时、或者连续佩戴达到4小时、口罩沾上液体，必须马上更换口罩。（二）NIOSH N95口罩的适合度检测每个实验员在选择N95口罩时，应进行适合度检测（fit test）以选择合适型号的口罩。适合度检测的方法和设备产品很多，考虑到成本和可操作性，现以3M公司的测试产品为例进行说明。1、 测试设备和材料主要包括:（1）头套式面罩（2）敏感性测试喷雾器（3）测试喷雾器2、测试程序测试前注意事项：l 受试者应了解测试过程中会吸入微量的苦味剂（苯酸苄胺酰铵，Denatonium benzoate）。由于使用浓度极低,在通常使用条件下是安全的。l 受试者在检测前15分钟内不得进食、喝饮

23、料（水除外）或咀嚼口香糖； l 检测原理是通过受试者的味觉是否感受到苦味，从而判定口罩是否适合，因此在测试过程中要求受试者呼吸为张口呼吸，并将舌头适当伸出。（1） 敏感性测试带上头罩，不佩戴N95口罩，使用敏感性测试喷雾器通过面罩上的管道（正对着口鼻）向面罩内喷测试液，如果被测试人员感觉到测试液的味道，说明此人对测试液敏感，可以进行下一步测试，如果喷入30次受试者仍然感觉不到，应改变测试液或测试方法。（2） 测试试验 (约10分钟)记录被测试口罩生产厂家、型号，准备测试；摘下面罩，按照上文所述，进行正确的N95口罩佩戴，然后带上面罩。使用适合性测试喷雾器将适合性测试喷入头罩，次数与敏感性所需次

24、数相同，至少喷10次。每项测试每隔30秒钟，再将测试液喷入头罩，次数为敏感性所需次数的一半。l 正常呼吸测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，瞩被测试人员进行正常呼吸约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 深呼吸测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，嘱被测试人员进行深呼吸约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 摇头测试： 使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，嘱被测试人员向左向右摇头约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 点头测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩

25、喷测试液，嘱被测试人员进行低头和抬头约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 言谈测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，嘱被测试人员持续说话约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 运动测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，嘱被测试人员进跳跃运动约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 正常呼吸测试：使用测试喷雾器通过面罩上的管道，向面罩喷测试液，嘱被测试人员进行正常呼吸约60秒，如果被测试人员没有感觉到测试液的味道，进行下一步测试；l 记录各项测试报告结果，测试人员和被测试人员签字确

26、认。生成测试记录，存档备查。如果以上任何一个步骤被测试人员闻到测试液的味道，则适合度测试不合格，这种型号的口罩不适用于被测试人员。四、手套1手套的作用：预防样本、试验物品上的病原微生物传播给实验室人员。在接触病人的样本时，或接触实验室污染物品时应戴手套。2戴手套原则：戴手套之前应检查手套气密性，用手将手套手掌部撑开后，抽出手后将握紧手套腕部，逐步挤压手套手掌部分、手指部分，观察手套是否膨胀而不漏气。手套腕部应罩住防护服腕部。3脱手套方法（1）一手捏住手套污染面的边缘将手套脱下。（2）用脱下手套的手指插入另一只手套清洁面(内面)的边缘，将手套脱下。4注意事项（1）操作完成后脱去手套，必须按规定程

27、序与方法洗手，戴手套不能替代洗手，必要时进行手消毒。（2）戴手套操作中，如发现手套有破损时应立即更换。五、帽子1. 帽子的作用：主要预防医务人员头发受到感染性物质污染，预防微生物通过头发上的灰尘、头皮屑等途径污染环境和物体表面。2. 帽子的分类：根据制作材质的不同，帽子可分为一次性帽子及布类帽子两类。3. 注意事项（1）布制帽子每次试验结束后更换，高压后清洁。（2）如被样本或污染物质污染时应立即更换。（3）一次性帽子不得重复使用。（4）每次戴帽子应将头发置于帽子内。六、手卫生手卫生是指所有手部清洁行为的通称，包括洗手、卫生手消毒和外科手消毒。这里只介绍洗手和卫生手消毒。洗手是指用普通或者抗菌肥

28、皂（皂液）和流动水洗手，清除手部皮肤污垢和暂居菌的过程。卫生手消毒是指使用速干手消毒剂（主要为酒精擦手液即揉搓手，减少手部暂居菌的过程，无需冲洗或干手设备。（一） 洗手1.采用流动水洗手，使双手充分浸湿；2.取适量皂液，均匀涂抹至整个手掌、手背、手指和指缝；3.认真揉搓双手至少15秒钟，应注意清洗双手所有皮肤，清洗指背、指尖和指缝，具体揉搓步骤为：（1）掌心相对，手指并拢，相互揉搓；（2）手心对手背沿指缝相互揉搓，交换进行；（3）掌心相对，双手交叉指缝相互揉搓；（4）右手握住左手大拇指旋转揉搓，交换进行；（5）弯曲手指使关节在另一手掌心旋转揉搓，交换进行；（6）将五个手指尖并拢放在另一手掌心旋

29、转揉搓，交换进行；（7）对手腕的清洗。4.在流动水下彻底冲净双手，用纸巾或烘手机干燥双手。（二） 手消毒脱去手套后，医务人员手无可见污染物时，可以使用速干手消毒剂消毒双手代替洗手。具体方法是：1. 取适量的速干手消毒剂于掌心；2. 严格按照洗手的揉搓步骤进行揉搓；3. 揉搓时保证手消毒剂完全覆盖手部皮肤，直至手部干燥，使双手达到消毒目的。第二章 比例法药敏试验标准化操作程序第一节 培养基的制备推荐用于分枝杆菌药敏试验的基础培养基为中性改良罗氏培养基。一、设备和材料1. 天平(灵敏度为0.01g)2. 分析天平（灵敏度为0.0001g）3. 称量匙或勺、称量纸4. 高压灭菌器或电炉5. PH计6

30、. 蒸汽凝固器（带有斜面隔架）7. 培养基分装机或简易分装装置8. 打蛋器9. 水浴10. 培养管（螺旋盖）11. 广口瓶、锥形瓶、量桶、刻度吸管12. 镊子13. 消毒纱布、漏斗（过滤混匀的鸡蛋）14. 棕色瓶15. 培养基制备的一般仪器和玻璃容器二、试剂和溶液1. 70% 乙醇2. 2% 孔雀绿溶液，单独配制· 孔雀绿染料 2 g· 灭菌去离子水100 ml使用无菌技术溶解染料于灭菌去离子水中（放置于36°C温箱中小时）或者在水浴中加热。配制好的溶液储存于深色瓶中。此溶液长时间放置并不稳定，如果发生沉淀，应丢弃并重新配制。3. 二甲基甲酰胺试剂：用于溶解水溶性

31、较差的抗结核药。4. 表2-1 培养基盐溶液成份改良LJ, (IUATLD/WHO)磷酸二氢钾 (KH2PO4)2.4 g硫酸镁 (MgSO4 ·7H20)0.24 g枸橼酸镁（Magnesium citrate）0.6 gL-半胱氨酸（L-Asparagine）3.6 g谷氨酸钠（Sodium glutamate）蒸馏水600 ml甘油（Glycerol）12 ml鸡蛋匀液1000 ml2% 孔雀绿（Malachite green ）20 mlpH值6.8将各种盐类成分溶解于灭菌蒸馏水中，煮沸30分钟或者121°C灭菌分钟，制备成盐溶液，冷却待用。三、基础液的制备1、清洁

32、、消毒桌面。2、用肥皂水清洁鸡蛋，并用70%乙醇擦洗，晾干。3、鸡蛋开口，打入灭菌的容器内，观察新鲜度。4、将新鲜的鸡蛋转移到加大容器内。5. 将鸡蛋打碎，充分匀化。6. 用无菌纱布过滤鸡蛋液，至所需体积（如上表所示）。7. 将鸡蛋液中加入冷却的盐溶液中。8. 加入孔雀绿溶液。9. 缓慢混匀所有的成分，避免气泡。四、对照培养基1. 将上述基础液无菌分装至培养管中，每管6-8 ml。2. 将试管放在架子上，摆成合适的斜面。3. 放在蒸汽凝固器中85°C 50分钟。4. 将凝固后的培养基从蒸汽凝固器取出，并作标记。5. 培养基试管恢复到室温时旋紧螺旋盖（否则冷凝将会产生更多的水）。6.

33、将培养管直立，放置于37°C温箱中24小时。7. 检查培养基污染情况后，将培养基直立放置4°C冰箱中，最好放在塑料袋或者容器内。8. 培养基标记应包含的内容请参考下文（培养基储存）。五、含药培养基：1.药液的制备：· 用于含药培养基制备的药液应现用现配。· 首先在无菌容器内称取药物粉末，为减少称量误差，每次应至少称重10mg。· 按不同药物标定的效价精确计算其有效含量，分别计算每种药物应加入的溶剂体积，使得药物浓度如表22所示，效价公式如下：效价纯度×活性成份比例×（1水份含量）表22 含药培养基药液浓度溶剂及培养基含药终浓

34、度药物(英文缩写)药液浓度(g /ml)溶剂培养基内终浓度(g /ml)异烟肼（INH）20灭菌蒸馏水0.2链霉素（SM）400灭菌蒸馏水4乙胺丁醇（EMB）200灭菌蒸馏水2利福平（RFP）4000二甲基甲酰胺40卡那霉素（KM）3000灭菌蒸馏水30氧氟沙星（OFX）3001NaOH3卷曲霉素（CPM）4000灭菌蒸馏水40乙硫（丙硫）异烟胺(ETO/PTO)4000二甲基甲酰胺40对氨基水杨酸（PAS）100灭菌蒸馏水1· INH、SM、EMB、KM、CPM、PAS用灭菌蒸馏水溶解，RFP、ETO/PTO用少量二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量；OFX用少量1NaOH至溶解

35、后，加灭菌蒸馏水至所需量。2含药培养基的制备：· 按实际需要量每100 ml基础培养基中加入1 ml药液，充分混匀。· 将含药培养基无菌分装至培养管中，每管约7 ml。· 将试管放在架子上，摆成合适的斜面。· 放在蒸汽凝固器中85°C 50分钟。· 将凝固后的培养基从蒸汽凝固器取出，并作标记。· 培养基试管恢复到室温时旋紧螺旋盖（否则冷凝将会产生更多的水）。六、培养基储存和运输1储存为了避免剩余过多过期的培养基，制作或者够买培养基时要按照约两个月的工作量进行估算。培养基应储存冷藏、密封、避光保存。在此保存条件下，无药对照培养

36、基保存期限不超过2个月，含药培养基保存期限为1个月。标记应该显示：· 培养基的名称· 制作者的名称（实验室标示）· 批号或者制作日期· 效期（可以用于接种的最后期限）· 储存条件（避光、4-8°C）2运输培养基可在常温下运输，但要确保不受阳光的照射，不要过热或者过于干燥。第二节 药敏试验菌株的准备应尽量使用原代培养物进行药敏试验，若培养物不能直接用于药敏试验操作，应在传代或前处理之后，待获得理想的二代培养物之后进行药敏试验。一、临床标本初分离的菌株 若具备以下特点，临床标本初分离的菌株可直接用于药敏试验： 1. 出现肉眼可见菌落后12

37、周的新鲜菌落2. 没有其他污染菌共存3. 涂片确认为抗酸菌二、需要二次传代的菌株 以下情况需要二次传代后才能进行药敏试验： 1 固体培养基上生长老化的菌落： 出现肉眼可见菌落后，培养基上的菌落逐渐呈现干燥、变硬的特点，培养基出现干燥、裂缝现象，这样的菌落需要进行传代，待菌株重新恢复到对数生长期方可进行药敏试验。（1）准备：· 待传代菌株· 罗氏培养基（每株2管）· 接种环· 灭菌生理盐水· 磨菌瓶（带有玻璃珠的无菌螺旋盖小瓶）· 无菌微量吸管（2）操作：· 用灭菌的接种环刮取菌落，无菌手法涂抹至罗氏培养基斜面；·

38、若菌落坚硬难以在斜面上涂抹，可用接种环轻轻刮取菌落，置于磨菌瓶中；· 滴加少量生理盐水，旋紧螺旋盖，在涡旋振荡器上振荡1020秒，制成均匀的菌液；· 静置10分钟后，用吸管接种约0.1毫升至中性罗氏培养基斜面上；· 传代后的培养基放置36培养，每周观察菌落生长情况，于肉眼可见菌落出现后12周进行药敏试验；· 上述操作需在II级生物安全操作柜内进行。2固体培养基上部分污染的菌落： 有些初分离的菌株，若肉眼观察同时混有其他细菌的污染，或在涂片染色后镜下发现AFB与其他细菌共存时，需要对菌株进行去污染处理后传代，以获得分枝杆菌的纯培养物用于药敏试验。（1）准备

39、：· 待传代菌株· 罗氏培养基（每株2管）· 接种环· 2氢氧化钠溶液· 带有玻璃株的螺旋盖试管（无菌）· 无菌微量吸管· 涡旋振荡器（2）操作：· 用灭菌的接种环挑取斜面上的菌落，尽量不碰触污染部分；· 将菌落置于放有玻璃株的无菌试管内，滴加45滴2氢氧化钠溶液；· 旋紧螺旋盖，在涡旋振荡器上振荡1020秒；· 静置15分钟；· 用吸管将去污染处理过的菌液接种至罗氏培养基斜面；· 培养基放置36培养，每周观察菌落生长情况，于肉眼可见菌落出现后12周进行药敏试验；&

40、#183; 上述操作需在II型生物安全操作柜内进行。第三节 菌液的制备一、设备和材料1. II级生物安全柜2. 涡旋振荡器3. 待测菌株4. 培养基5. 接种环6. 无菌试管磨菌瓶：为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径23mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。二、试剂和溶液1. 灭菌生理盐水2. 麦氏比浊管（MacFarland No.1）：0.1ml 1% Bacl2加入9.9ml 1%H2SO4，封口，比浊前摇匀。3. 10吐温-80三、操作1. 在磨菌瓶中加入12滴10%吐温-80水溶液；2. 用无菌吸管尖端或火焰消毒的接种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中；3. 注意尽可能刮取斜

41、面各个部位的菌落，避免挑取1、2个单独菌落进行试验，刮取菌落的量以半环或一环（510 mg）为宜；4. 旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡1020秒；5. 静置5分钟，小心打开瓶盖，加入约2毫升灭菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀；6. 用无菌吸管吸取中上部的菌液，约1ml，转移到另一无菌试管中，与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）比浊；7. 逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即得到1mg/ml的菌液；8. 上述操作需在II级或II级以上生物安全操作柜内进行。第四节 接种一、设备和材料1. II级生物安全柜2. 22 SW

42、G标准接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径3mm，1满环（见图1）移液0.01ml3. 培养基水平搁架4. 无菌、带有螺旋盖的试管5. 无菌刻度吸管（5ml）图3 22SWG标准接种环移液液面示例（接种环取满环液体时，水平观察液面上下略凸出接种环平面）二、试剂和溶液· 灭菌生理盐水三、操作1、菌液稀释：· 在无菌、带有螺旋盖的试管中以无菌手法加入2ml灭菌生理盐水备用，每株待测菌准备2管； · 菌液静置，待颗粒或菌块沉淀；· 用22 SWG标准接种环取2满环1mg/ml的菌液，平移至的2ml灭菌生理盐水中，即稀释成10-2mg/ml菌液；·

43、 用同样方法再进行100倍稀释，即成10- 4mg/ml菌液。2、接种：· 用22 SWG标准接种环分别取1满环（即0.01ml ）10-2mg/ml和 10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面；· 最终接种菌量为10-4mg和10-6mg;3、上述操作需在II级或II级以上生物安全操作柜内进行。第五节 培养一、设备和材料1. 恒温培养箱2. 温度计二、操作1. 接种后的培养基直立放置于恒温培养内, 36培养；2. 培养4周后报告结果。第六节 结果的判读和解释一、结果记录方式每次检查完培养基后，按以下方式在实验

44、室记录本上记录菌落生长情况：表2-2 药敏生长情况判读菌落生长情况报告方式无菌落生长少于50个菌落实际菌落数50100个菌落1+100200个菌落2+大部分融合（200500个菌落）3+融合（大于500个菌落） 4+ 二、 耐药百分比的计算和解释 含药培养基上生长的菌落数· 耐药百分比= -× 100% 对照培养基上生长的菌落数· 若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药三、结果记录和报告参考以下方式记录药敏试验结果。27药敏试验登记本参考式样（比例法）接种日期药敏序号姓名病例编号或菌株来源菌液浓度对照HSERKOPNB报告日期签名备注24判定24判定2

45、4判定24判定24判定第七节 废弃物处理我国于2003年7月颁布了医疗废弃物管理条例，医疗卫生机构医疗废物管理办法将医疗废物管理纳入法制化轨道，并逐步完善其管理机制。我国医疗废物一般分以下几类：（1）感染性废物（2）病理性废物（3）损伤性废物（4）药物性废物（5）化学性废物五大类。对医疗废弃物应进行分类收集处理，杜绝医疗废物与生活垃圾混合收集的现象存在。感染性废弃物应置黄色塑料袋内密封运送、无害化处理；针头、针筒、导管等一次性用品进行毁形处理，消毒后运送和无害化处理。各医疗机构要按照条例要求建立医疗垃圾分类收集、专人管理制度，并加上识别标志。携带结核杆菌具有引发结核杆菌传播危险的废物均应进行相

46、应的感染性废弃物处理。最常用的也是有效的处理含结核菌的固体废弃物的方法为高压蒸汽灭菌法，利用高温高压蒸汽消灭细菌，在103KPa、121条件下，维持30分钟能杀灭一切微生物。详见本手册第五章相关内容。药敏试验结束后剩余的菌液、稀释管、用过的吸管、废液缸、佩戴后的防护面罩、衣服、帽子、手套等，均应高压灭菌处理。结束结果观察的培养基，无论是否有肉眼可见菌落，若无进一步检测的需要，均需及时进行高压灭菌。处理方法为高压蒸汽灭菌法，灭菌条件为121条件下，维持30分钟。第八节 菌株的短时保存和运送一、保存条件培养阳性的培养管，在送往药敏实验室前，应在冷藏环境下短时保存，保存时应注意旋紧培养管螺旋盖，在箱

47、里的保存位置相对固定。二、菌株保存的安全管理 保证冰箱和/或放置冰箱的房间上锁，门窗牢固。三、菌株运送按照卫生部45号令可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定进行申请，省内运送应向省级卫生行政部门申请；跨省运送应先向省级卫生行政部门初审，申请获得通过后，再向卫生部申请，以获得卫生部有关运送的批件。获得批准文件后，按照A类包装的要求进行三层包装，包括1. 初始包装（即培养管）：标本容器外并附有足够的吸附材料吸附泄漏产生的所有液体。2. 第二层包装：必须使用耐用的、防水的、防泄漏的螺旋盖的塑料容器，几个垫开的初始包装可以放在同一个二层包装内，但是必须有足够的吸附材料以吸附发生泄

48、漏时的所有液体。3. 外包装：第二层包装应该放在外层包装内，并有合适的垫子。外层包装保护内容物免受外界的影响，如运输时的物理损坏。冰应该放在第二层包装外防泄漏的容器应内。第三章 绝对浓度法药敏试验标准化操作程序第一节 培养基的制备推荐用于分枝杆菌药敏试验的基础培养基为中性改良罗氏培养基。一、设备和材料同第二章比例法二、试剂和溶液同第二章比例法三、基础液的制备同第二章比例法四、对照培养基同第二章比例法五、含药培养基：（一）药液的制备：1. 用于含药培养基制备的药液应现用现配。2. 首先在无菌容器内称取药物粉末，为减少称量误差，每次应至少称重10mg。3. 高浓度药物工作液：ü 按不同药

49、物出厂标定的效价精确计算其有效含量，分别计算每种药物应加入的溶剂体积，使得药物浓度如下所示：INH：1000g /ml SM： 10000g /ml RFP：25000g /ml EMB：5000g /mlPAS：1000g /mlü INH、SM、EMB、PAS用灭菌蒸馏水溶解，RFP用少量二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量。· 低浓度药物工作液：将上述高浓度工作液按不同比例，用灭菌蒸馏水进行稀释，使得稀释后的低浓度药液浓度如下所示：INH：100g /ml （10×稀释）SM：1000g /ml （10×稀释） RFP：5000g /ml （5&

50、#215;稀释）EMB：500g /ml （10×稀释）PAS：100g /ml （10×稀释）（二）含药培养基的制备：1. 先制备低浓度含药培养基，再制备高浓度含药培养基；2. 按实际需要量每100 ml基础培养基中加入1 ml药液，充分混匀；3. 将含药培养基无菌分装至培养管中，每管约7 ml；4. 将试管放在斜面架上，摆成合适的斜面；5. 放在蒸汽凝固器中85凝固50分钟；6. 将凝固后的培养基从蒸汽凝固器取出，并作标记。含药培养基中药物终浓度如下表所示（ug /ml）：药物*高浓度低浓度INH101SM10010RFP25050EMB505PAS101*根据国内中华

51、医学会结核病学分会和中国防痨协会的结核病细菌学相关的规程，绝对浓度法还包括其它抗结核药物，本手册暂不列入。· 培养基试管恢复到室温时旋紧螺旋盖（否则冷凝将会产生更多的水）。· 将培养管直立，放置于36°C温箱中48小时。六、培养基储存和运输同第二章比例法第二节 药敏试验菌株的准备同第二章比例法第三节 菌液的制备同第二章比例法第四节 接种一、设备和材料1. II级生物安全柜2. 培养基水平搁架3. 无菌、带有螺旋盖的试管4. 无菌刻度吸管（5ml）5. 无菌刻度吸管（0.5ml）二、试剂和溶液灭菌生理盐水三、操作1菌液稀释：· 在无菌、带有螺旋盖的试管中以

52、无菌手法加入4.5毫升灭菌生理盐水备用，每株待测菌准备2管； · 菌液静置，待颗粒或菌块沉淀；· 用0.5毫升无菌吸管吸取0.5毫升1mg/ml的菌液，移至预先准备好的4.5ml灭菌生理盐水试管中，即稀释成10-1mg/ml菌液；· 用同样方法再进行10倍稀释，即成10- 2mg/ml菌液。2接种：· 用0.5毫升吸管吸取10- 2mg/ml菌液，分别接种0.1毫升至每一管对照、高浓度和低浓度含药培养基表面；· 应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面；· 最终接种菌量为10-3mg;· 接种后的培养基置于水平搁架上。3上述操作需在II级生物安全操作柜内进行。第五节 培养同第二章比例法，36条件下，保持培养基斜面水平放置24小时后，直立继续培养至4周。第六节 结果的判读和解释一、结果记录方式 每次检查完培养基后，按以下方式在实验室记录本上记录菌落生长情况：菌落生长情况报告