各突变检测方法比较

1、精选优质文档-倾情为你奉上1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。电泳法（不能

2、确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区

3、域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。当加了GC

4、 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。3、 PCR-SSCP法 单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)是一种分离核酸的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。实验步骤利用PCR从提取出的DNA中扩增16S rRNA基因。利用-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个PCR引物被磷酸化，这条链将被去除）。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 应用：单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。可对其中的某一个条带进行测序，并与数据库中已知序列比对。原理：单链

5、DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。4、杂合双链分析法(HA)由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者被分离开。该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。HA法简单迅速,但只适用于200300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将HA法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%,也有科研工作者建

6、议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度。5、化学切割错配(CCM)化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNADNA或DNARNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变。只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb

7、的片段分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。6、碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。该方法的最大优点也是能对12kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质,有报道曾用该法检测出了7.2kbDNA片段中的一个点突变,但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。7、酶促切割错配(EnzymeMismatchC

8、leavage,EMC)EMC是一种与RNaseA切割相类似的方法。T4核酸内切酶 是一种分解酶(resolvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割，酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变，电泳产物的检测可用放射自显影，也可用银染。由于该法能对DNADNA异源杂合分子进行分析，因而省去了体外转录的步骤，其最长检测片段可达到1.5kb，该法的缺点是存在非特异性切割现象，并且对有些错配碱基的识别不是100%，因此在每次检测时都必须设有一个内对照。8、限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism , RFLP)连琐

9、分析技术RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取用限制性内切酶酶切DNA用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（）和结果分析。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。发展：反向限制性位点突变分析（iRSM），

10、进行低突变频率等位基因的检测。其方法主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E1位点）的消失，产生一新的酶切位点（E2位点），称之为E1E2突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。此时，用一内切酶(E1)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列（>99%）。无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E2位点的一侧），产物用另一内切酶（E2）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值

11、得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量。9、切割片段长度多态性(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术，其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA

12、的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而CleavaseI外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱。10、PCR-ELISA结合微测序检测点突变（PCR-ELISA & mini-sequencing） 新近有报道称：使用PCR-ELISA结合微测序检测到无临床症状且未经抗病毒药物治疗的乙肝患者HBV基因的YMDD主题突变区存在天然Lamivudine耐药基因。其检测原理如下：探针结合区野生型HBV基因序列：5-739ATA CGG744 A-3, 针对突变区域

13、设计的探针，Wild-Probe: 5-ATA CGG-3；Val-Probe: 5- ATG TIG-（针对741742位点突变，743位点设计摆动配对）；Ile-Probe: 5-ATA TAG-3、5-ATA TCG-3、5-ATATCG-3（针对743位点突变）。变性的扩增产物与上述3种类型探针杂交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微测序缓冲液55温育。如果Val或Ile探针与靶DNA完全匹配，探针3末端延伸一个带标记的腺嘌呤。反之，不匹配时，探针Tm降低，3末端游离而不延伸标记的腺嘌呤。利用链酶亲和素酶标系统检测探针上标记的生物素，可判断样品中是否存在点突变。

14、而近期我们所进行的点突变检测是基于PCR-ELISA和杂交链稳定性的基础上发展起来的，主要是利用野生型和突变型序列与探针结合后在Tm值上的差异进行检测。 近年来随着新技术、新材料的不断涌现，已知基因单位点突变检测技术将会得到迅速的发展，从而距离理想的突变扫描方法（即：对大片段DNA进行突变扫描，100%的检出率，无假阳性或假阴性现象，不需复杂的设备、花费低、不需使用有害试剂和同位素、高效率、耗时短。）越来越近。 11、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）优点：高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异

15、性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等。在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。DHPLC高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。在很多的研究中，DHPLC色谱

16、图有改变的样本经测序均显示DNA有变异；在我们的前期工作中曾用该方法检测了大量样本，特异性及敏感性均接近100%，提示该方法是一种高效、可靠的突变检测方法。该方法的不足之处是无法得出具体的突变位点及突变类型，还需DNA测序方法证实。12、DNA测序(Sequencing)由各种突变检测技术检测到的突变最后都得由测序来确定突变类型及突变位置,而且测序法检测突变的效率达到100%。但缺点是花费昂贵,所以对一些较大的,外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变,同时也不适用于临床对大量的标本进行检测,此外,测序也不能被当成是突变检测的金标准,杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序

17、获得精确的数据。Sanger法测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶

18、片放射自显影或非同位素标记进行检测。13、双脱氧指纹图谱法(DideoxyFinger-printing,ddF)由于SSCP检测方法的灵敏度受到电泳温度、PCR片段大小等因素的影响,而直接DNA测序的方法又费时、费钱，因此有研究工作者在实际应用中将SSCP和Sanger双脱氧测序法结合起来形成一种新的突变检测方法,即ddF。该方法的基因原理是:将PCR产物回收纯化后用两个引物分别做Sanger双脱氧测序反应,但不同的是仅加入一种双脱氧终止剂,反应产物跑中性聚丙烯酰胺凝胶电泳如果确有突变的话,在病人的电泳图谱上将会丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改变。在ddF方法中,DNA链的迁

19、移率不仅取决于其二级结构,而且与其大小相关,因而较SS-CP法更为灵敏。MartincicD等曾经将SSCP法和ddF法进行了比较,发现ddF能将10种已知的p53抑瘤基因突变全部检测出来,而SSCP法只能检测到10种突变中的6种。ddF法的灵敏度不受电泳温度的影响,所能检测到10种突变中的6种。ddF法的灵敏度不受电泳温度的影响,所能检测的PCR产物长度也能达到近500bp,并且该法还能对突变位置进行相对定位。该法的主要缺点是需要使用同位素,同时对回收的PCR产物纯度要求较高,非特异的PCR产物将严重影响到最后结果的分析。14、寡核苷酸连接分析法(oligonucleotide ligati

20、on assay，OLA)该技术使用1对标记的探针，其中1条探针3'端包含等位基因特异性碱基。先用PCR扩增包含HPA基因SNP位点的基因片段，然后探针和扩增的等位基因片段互补结合，在DNA连接酶的作用下，2条探针连接形成一个双标记的产物。这个双标记产物的一端连于固相表面，另一端的标记物作为指示物，可以用ELISA方法检测。该法快速、可靠，可以用于大量样本的基因分型，但是OLA法也需要一些PCR后的操作，需要序列特异性探针。15、熔解曲线分析法：染料法和FRET法 基于荧光共振能量转移（FRET）原理的熔解曲线分析法是罗氏公司的专利技术。FRET法使用2个探针，一条探针横跨HPA（血小

21、板特异性抗原）的SNP位点，称为检测探针。另一条探针与第一条探针相距15个碱基称为锚定探针。两条探针互相邻近的3'端和5'端分别标记上荧光物质FITC和LightCycler Red 640。在PCR过程中，两条探针和扩增产物结合，荧光物质FITC和LightCycler Red 640相互靠近。FITC受激发产生荧光，又激发Red640，使其发出波长为640的荧光，通过检测器检测荧光信号。在PCR反应后，降低体系温度到探针退火的温度以下，然后缓慢提高温度，检测探针发生解链从模板脱离，产生1个熔解曲线。如果检测探针和靶基因完全互补，将会产生一个较高的解链温度（Tm），如果发生错

22、配将会产生1个较低的Tm，依据Tm的不同而将其分离。但该方法需要特殊的仪器LightCycler荧光定量PCR仪。除了使用FRET技术之外，还可以使用DNA荧光染料作为荧光的来源，通过扩增子或未标记探针的熔解分析法来进行基因分型。Liew等使用该法对HPA进行了基因分型并和FRET探针法进行比较，发现这2种方法的一致性达98.8。Liew等进一步的研究表明，使用扩增子的熔解分析法在分析长片段的扩增子时，存在一定的错误率，而使用未标记探针的结果则是完全准确的。这种点突变分析技术的特点是简单、快速、自动化程度较高，易于推广。基于荧光染料的熔解分析法无需价格昂贵的荧光标记的双杂交探针，而且每一个反应

23、体系可以同时鉴定HPA两个系统的等位基因，比FRET探针法更有优势。但是其需要特殊的熔解分析仪以及一种特殊的DNA荧光染料。16、PyrosequencingPyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。第一步测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）和底物adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。

24、 第二步四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对（AT，CG），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。第三步ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。ATP su

25、lfurylasePPi+APS > ATPLuciferase，ATPLuciferin > oxyluciferin     光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第四步ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。第五步然后加入下一种dNTP。    在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram的信号峰中决定。     利用PSQ96系统进行测序分析可

26、期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。最佳化的Pyrosequencing    Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%。* 底物浓度已最佳化* 选择了Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS* dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP 数目

27、* 仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量待测序模扳制备    通过PCR技术将待测序列扩增，其中引物之一在合成时用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。PSQ 96系统系统工作流程1, 基因组DNA提取2, 设计和合成PCR引物，其中之一标记生物素; PCR反应3，DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火4，对含生物素的单链DNA的测序/基于测序的

28、SNP分析及等位基因频率确定PSQ96系统包含了进行上述工作（3-4）的仪器及配件、软件、试剂，系统的设计满足高通量、快速、精确和经济的要求。Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高；17、等位基因特异性扩增技术（allele-specific PCR或 amplification , ASPCR或ASA） ASPCR是一项在PCR基础上发展起来的新方法，通过PCR和凝胶电泳即可检测出DNA中各种点突变。 ASPCR的基本构思是设计2个ASO引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。这2个引物与探针的ASO不同，等位基因特异性碱基不是位于ASO中间，而是置于引物的3端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏35外切校正活性的特点。引物3端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3,5-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系（amplification refractory mutation system , ARMS）。其扩增结果为：“野生”模板阻碍,“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍,“野生”引物放大。 ASPCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生的错配延伸，这可通过调整实验条件如：引物