KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

1、KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究         11-01-31 14:44:00     编辑：studa20                  作者：张晓静, 葛银林*, 侯琳, 李泉【摘要】  目的: 采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(

2、KDR)基因表达, 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰（RNAi）技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。方法: 采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF7, 诱导RNAi, 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法, RTPCR, Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化。采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤, 监测肿瘤生长变化, RTPCR, 免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化。结果: 靶向KDR基因siRNA转染MCF7

3、后, 细胞增殖被抑制, KDR mRNA和蛋白的表达明显降低; 裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制; RTPCR, 免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调。各对照组指标无明显变化。结论: 化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF7细胞增殖, 是潜在的肿瘤治疗新方法, 而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。 【关键词】  RNA干扰 siRNA MCF 7细胞 血管内皮生长因子受体2 基因治疗Abstract  AIM: To inhibit kinase insert domaincontaining receptor

4、(KDR) expression chemically modified siRNA in vitro and in vivo and to investigate the feasibility and specificity of gene therapy for breast cancer. METHODS: In vitro, siRNA was transfected into MCF7 cells to induce RNAi by using cationic liposome Lipofectamine2000TM. The changes of KDR mRNA and pr

5、otein expression in both siRNA treatment group and control group were measured by MTT assay and RTPCR, In vivo, the siRNA was transfected into transplanted tumor in nude mice by using cationic polymer nanoparticle In vivo jetPEITM. Tumor growth was observed. The mRNA and protein expression of KDR wa

6、s measured by RTPCR and immunohistochemical staining. RESULTS: Experiments in vitro showed that siRNA directed against KDR effectively inhibited the proliferation of MCF7 cells and downregulated KDR mRNA expression. In vivo, the growth of tumor was visibly suppressed. Furthermore, RTPCR and immunohi

7、stochemical results indicated that KDR mRNA and protein expression was reduced in excised tumors. CONCLUSION: RNAi mediated by chemically modified siRNA markedly decreased KDR gene expression and inhibited cellular proliferation. It may have the potential as a therapeutic method to treat human cance

8、r.KeywordsRNAi; siRNA; MCF7; VEGFR2; gene therapy恶性肿瘤生长过程中, 肿瘤组织内细胞急剧、 持续性增殖的病理生理学基础是肿瘤组织内血管的再生。有研究认为, 含激酶插入区受体(kinase insert domaincontaining receptor, KDR), 即血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2）在血管内皮和部分肿瘤细胞, 包括乳腺癌细胞上特异性表达, 对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用, 在肿瘤发生、 发展中起重要的调节作用1 。

9、肿瘤细胞分泌VEGF, 除了以旁分泌的形式作用于血管内皮上的KDR, 促进血管形成外, 还以自分泌的方式作用于自身细胞上的KDR, 直接促进肿瘤细胞生长2, 3。所以, 抑制KDR 的表达, 可以在两个水平上抑制肿瘤生长。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一项新兴的基因治疗技术4, 是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。siRNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效应分子。我们依据RNAi原理, 设计合成以KDR为靶的siRNA, 并对其进行化学修饰, 增强其在体内外的稳定性, 并以人类

10、乳腺癌细胞株MCF7为研究对象, 在体外细胞水平及裸鼠动物水平, 探讨siRNA对KDR基因特异性沉默及对细胞和瘤体增殖的抑制作用。1  材料和方法1.1  材料  乳腺癌MCF7细胞株购自中国协和基础学院细胞中心, 常规培养于含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM(Gibco公司产品)培养液中, 50 mL/L CO2、 37饱和湿度的孵箱中培养传代。BALB/c nu/nu裸小鼠（雌性, 4周龄, 体质量1214 g）, 购自上海斯莱克动物有限公司, 按规定饲养于无菌动物试验室, 经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。LipofectamineTM2000

11、及TRIzol为Invitrogen公司产品; In vivo jetPEITM为Poly Plus公司产品; AMV 逆转录试剂盒购自Promega公司; 鼠抗flk1多克隆抗体（sc6251）为santa cruz公司产品; 免疫组化检测试剂盒PV6002购自北京中杉公司; ECL发光试剂购自北京普利莱公司。1.2  方法2  结果2.1  KDR siRNA的设计  根据人KDR mRNA的序列, 利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure 4.4, 将随机设计的siRNA与预测的mRNA二级结构对比, 选择出一条与预测的

12、KDR mRNA容易结合的siRNA,  其KDR siRNA序列为: 5GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3(正义链), 5UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3(反义链)。2.2  MTT比色法检测siRNA对肿瘤细胞生长抑制作用  转染KDR siRNA 48 h后, MCF7细胞增长明显减慢, MTT数据统计处理结果显示: KDR siRNA 4个浓度组A值与脂质体组比较有统计学意义（P<0.01）; 错义序列组（即siRNASCR组）与脂质体组比较差异不大（P>0.05）。100 nmol/L组和200 nmol/L组比较无统计

13、学意义。这表明:   KDR siRNA对细胞增殖的抑制作用, 在一定范围内抑制率随着浓度增加而增加, 达到一定浓度后, 再增加siRNA浓度并不提高沉默作用。各组A值及抑制率数值（表1）。表1  MTT比色法检测MCF7转染siRNA 48 h后增殖情况（略）Tab 1  Detection of proliferation of MCF7 cells 48 h after siRNA transfection by MTT colorimetrybP<0.01 vs blank control group.2.3RTPCR检测KDR mRNA表

14、达的变化与未转染组比较, 脂质体组与错义序列组无统计学意义; KDR siRNA 50nmol/L、 100nmol/L和200nmol/L 3组数据均有统计学意义（P<0.05）, 50 nmol/L与100   nmol/L和200 nmol/L组相比有统计学意义（P<0.05）, 而100 nmol/L和200 nmol/L这两组之间比较无统计学意义（图1）, 结果表明, 达到一定浓度的KDR siRNA转染细胞24 h后明显下调了KDR mRNA的表达, 与MTT法检测结果相符。图1  RTPCR检测转染siRNA 后MCF7细胞KDR mRNA表达水平（略）Fig 1  Expression of KDR mRNA in MCF7 cells transfected with siRNA measured by RTPCRRnasefree water was used as negative PCR control; GAPDH was used as a control. M: DNA markers; 1: