b肺癌化疗耐药分子标志与个体性化疗

1、肺癌化疗耐药分子标志与个体性化疗发表时间：2008-12-03发表者：肺癌诊治中心 (访问人次：748)转载自暨南大学附属第一医院肿瘤科 徐 萌    肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，世界每年肺癌发生超过150万，我国是肺癌的高发国家之一。化学药物治疗在肺癌综合治疗中占重要地位，其疗效一直不尽人意，主要原因是肺癌耐药产生，肺癌细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性，称为多药耐药(Multiple Drug Resistance，MDR)，药理遗传学(pharmacogenetics)和药理基因组学(pharmacogenomics)的研究表明，与肺癌多药耐药相关的基因及其

2、异常信号传导通路就称为肺癌耐药分子标志1。个体性化疗是根据肺癌患者药理遗传学和基因组学特点，采用特异和最佳的化疗药物方案，提高化疗疗效，尽量降低化疗副反应，最大延长患者生存期。因此，深入地开展肺癌化疗耐药及个体性化疗研究具有重要的临床现实意义。 国内外研究表明肺癌化疗耐药主要分子标志包括2：(1)多药耐药基因(MDR1)及其编码P-糖蛋白(P-gp)表达增加；(2)多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达增加；(3)谷胱甘肽解毒酶系统活性增强；(4)线粒体凋亡途径异常；(5)细胞质耐药因子ERCC1，-tubulin ，RRM1表达改变。 一、 肺癌化疗耐药分子标志 (一) MDR1基因  

3、;    采用RNA slot blot法分析24名肺癌患者和67个肺癌细胞系，14名患者(占28%)均中度表达MDR1 mRNA，45个细胞系(占67%)表达低水平MDR1 mRNA，细胞系研究表明MDR1在肺癌表达水平降低，其它耐药机制肯定参与肺癌对化疗的低反应性。另外检测24名未化疗的肺癌和14名化疗后的肺癌患者MDR1 mRNA水平，发现小细胞肺癌和未化疗的肺癌有低表达，对长春花碱化疗不产生反应。肺癌对化疗的反应性因组织类型而异，MDR1与肺癌愈后不佳有关，MDR1因素造成的耐药细胞系在化疗期间扩增而减少药敏细胞，大多数转移的非小细胞肺癌对顺铂、卡铂、VP

4、-16的化疗方案反应率低。研究表明MDR1基因的表达与肺癌的获得性多药耐药和预后不良反应相关，在未治疗的非小细胞肺癌MDR1呈低表达，多程化疗的MDR1基因表达升高，复发者呈高表达。 (二) MRP基因      在肺癌尽管耐药发生率很高，P-糖蛋白表达却较低，提示有其他的耐药机制参与4。用Northern杂交法检测MRP和MDRI在104名非小细胞肺癌患者的表达，有33名表达MRP，占31.7，33名中有19名(占57.6)为高表达，其中鳞癌占13名，有33.7患者表达中度到高度MRP，其预后较不表达者明显差，在非小细胞肺癌中MRP表达与组织病理和预后

5、相关；与此同时，只有9名患者(占8.7)表达MDR1，MRP分子在非小细胞肺癌的MDR中扮演重要角色。我们5检测32例肺癌组织和10例癌旁肺组织，发现在术前未接受化疗的肺癌中，MRP基因表达阳性率71.9%，初治肺癌有MRP基因高表达，提示大部分肺癌中先天存在原发性耐药，MRP分子在肺癌的MDR中扮演重要角色。MRP与肺癌先天性多药耐药相关，主要介导肺癌细胞对长春花碱类，足叶乙甙和抗生素类化疗药耐药，若MRP基因表达阳性，应尽量避免应用该类化疗药。 (三) 谷胱甘肽GST酶系统      临床实验显示GST阳性表达和顺铂、阿霉素耐药相关，但与丝裂霉素和长

6、春新碱耐药的关系不明显。GST的过表达通常与MDR1表达增加相关，GST可协助其底物通过药物排流泵。对耐顺铂的肺癌细胞的研究中发现，细胞质内的谷胱甘肽和过氧化氢酶含量增高，但抑制过氧化氢酶后药物敏感性无明显提高，而抑制谷胱甘肽后药物敏感性明显提高。在研究化疗前后肺癌细胞耐药情况时发现，化疗后株与化疗前株相比，对阿霉素的耐药性增加3倍，对顺铂的耐药性增加2.7倍，但未见MDR1基因表达，而GST水平明显升高，说明其化疗耐药性与GST活性有关6。 (四) 线粒体凋亡途径异常     半胱氨酸酶Caspase家族7，8是直接导致细胞解体的蛋白酶系统，在线粒体凋亡调控机制

7、中处于核心地位，MDR1编码的P-糖蛋白除经典的化疗药物排除泵功能外，尚具有对Caspase依赖的凋亡途径保护的作用，其抗凋亡的机制可能是P-糖蛋白使细胞内碱化，诱导一种新的Na+和Cl-依赖跨膜H+转运，导致细胞内pH值增加，使Caspase处于失活状态，从而对Caspase依赖的细胞凋亡具有保护作用。我们研究发现化疗药阿霉素诱导肺癌敏感细胞株Caspase活性显著升高，且Caspase-8活性增高早于Caspase-3，与凋亡级联反应的次序有关，而耐药株细胞Caspase活性增高低于敏感细胞，考虑Caspase-3和Caspase-8在参与肺癌耐药过程发生，MRP蛋白表达不仅导致细胞多药耐

8、药的产生而且与凋亡抗性形成有关，造成Caspase结构缺陷或激活阻断因素可以导致对化疗药物的抵抗和耐受。针对线粒体凋亡途径异常环节干预肺癌多药耐药是探索逆转耐药的新思路，对于进一步提高肺癌化疗敏感性具有重要意义。 (五) 细胞质耐药因子ERCC1，-tubulin ，RRM1 1. 错配切除修复酶(ERCC1)    ERCC1是核酸外切修复家族中重要成员，参与DNA链的切割和损伤识别，缺失有功能ERCC1的肿瘤细胞不能修复顺铂导致的DNA损伤，ERCC1 mRNA高表达和ERCC1的上调导致铂类药物的耐药。研究表明手术切除的中晚期非小细胞肺癌中ERCC1低表达接受吉西他滨

9、和顺铂联合化疗后生存期明显延长，同时ERCC1 表达阴性的肺癌患者接受辅助性化疗显著受益。另外，进展期非小细胞肺癌中ERCC1 mRNA低表达的患者中位生存期明显高于高表达者，ERCC1基因多态性与铂类高效有关，纯合子基因型对铂类的客观反应率明显好于杂合子基因。研究已证实ERCC1参与肺癌铂类化疗药物耐药发生，与肺癌疗效和生存期呈负相关，ERCC1阴性者对含铂类化疗药的辅助化疗显示良好的获益率，ERCC1水平可作为铂类药物耐药的关键基因之一。 2. 微管蛋白(-tubulin)    紫杉类和长春碱类化疗药物通过微管蛋白的异二聚体成微管相互作用而发挥抗肿瘤有丝分裂疗效。-b

10、utulin参与耐药机制与-tubulin表达增加，微管的动态不稳定性增加，同时改型-tubulin对紫杉醇不敏感有关，-tubulin的表达程度影响肺癌对紫杉醇和长春瑞滨的敏感性。研究发现紫杉醇耐药的肺癌患者中-tubulin基因改变者中位生存期较无基因突变者显著降低，因此可将-tubulin基因突变作为紫杉醇类药物一个重要的耐药分子指标。非小细胞肺癌中-tubulin 低表达者对紫杉醇敏感性较好，同时联合化疗反应率，肿瘤进展时间生存时间均与-tubulin 表达有关，-tubulin 是总生存期和进展生存期一个独立的预后因子。 3. 核糖核苷还原酶M1(RRM1)   

11、 DNA修复基因的表达状况可作为肺癌化疗的相对完整的预测因子。RRM1是DNA合成途径中的限速酶，使核苷酸二磷酸盐转变为脱氧核苷酸二磷酸盐，从而在DNA合成和修复中发挥重要作用，并参与吉西他滨的代谢途径，通过微阵列分析发现吉西他滨耐药患者中RRM1高表达，并证实吉西他滨耐药患者中RRM1表达水平同时对铂类药物治疗亦有影响。低RRM1 mRNA水平的肺癌患者对吉西他滨和顺铂敏感性相对较高，中位生存期延长，而高RRM1表达患者药效性和中位生存期明显下降。由于RRM1和ERCC是靶向化疗的敏感性分子指标。可根据基因表达高低选择个体化疗方案，RRM1高表达者建议避免使用吉西他滨，ERCC1阴性者可考虑

12、使用铂类药物治疗，可根据下列四种表达情况指导临床化疗： ERCC1(+)/RRM1(±)可选择紫杉醇/吉西他滨化疗方案；ERCC1(+)/RRM1(+)可选择长春瑞滨/紫杉醇方案；ERCC1(-)/RRM1(±)可选择铂类/吉西他滨方案； ERCC1(-)/RRM1(+)可选择铂类/紫杉醇方案，为制定肺癌个体化疗方案提供重要指导。 二、 肺癌化疗耐药的逆转策略      近年来国内外学者就逆转肿瘤细胞多药耐药进行了多方位探讨10，体外被证实具有逆转耐药活性的化合物或生物制剂，包括：钙通道阻滞剂；钙调蛋白拮抗剂；免疫调节剂；类固醇激素；

13、雌激素拮抗剂。由于临床肺癌患者有原发性耐药以及体内肿瘤细胞耐药倍数较低，目前还没有一种逆转化疗多药耐药的方法在临床广泛应用，主要原因包括:现有逆转剂老药新用，逆转耐药往往不是其主要功能，临床毒副作用大；生物制剂在体内不稳定，难以作用到靶点；临床耐药往往数种机制同时参与，只对单一机制起作用的逆转剂难以发挥显著的效应。国内外学者正在积极寻找高效、低毒、功能专一性强且作用靶点广泛的肿瘤耐药逆转剂。 (一) 逆转耐药分子介导的MDR      P-gp是一种能量依赖性药物输出泵，能将细胞内药物“泵”出细胞外。与P-gp有关的MDR一般称为典型MDR，易引起典型M

14、DR的药物一般是天然来源的疏水性药物，如长春花性物碱，应用抑制P-gp的药物是逆转MDR的一个重要手段11。如钙通道阻断剂导搏定能阻断P-gp功能，并能克服肿瘤MDR。GST在烷化剂类化疗药物诱导耐药中起重要作用。小细胞肺癌的GST表达远远低于肺腺癌和肺鳞癌，因此，临床上小细胞肺癌对化疗较为敏感。用GST抑制剂可以增加许多耐药细胞对烷化剂等化疗药物的敏感程度。DNA损伤修复的增加是亦参与耐药机制产生，用同样剂量的顺铂处理耐药细胞株和敏感细胞株，耐药细胞DNA修复合成的增加是敏感细胞的3倍，敏感细胞在顺铂处理后24小时，DNA修复恢复正常水平，而耐药细胞株的DNA修复合成持续升高，DNA修复抑制

15、剂也可以用来逆转耐药。 (二) 耐药基因siRNA     siRNA是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它将与目的基因同源的含2123个核苷酸的小分子干扰RNA片段导入靶细胞，与细胞内的内切酶、解旋酶形成诱导沉默复合体，并以siRNA为模板特异地识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的降解，从而抑制基因表达。针对耐药逆转药物的靶向性和导入性差的两大困难，新型MRP基因siRNA提供了一条高效和特异的逆转耐药策略，设计以MRP基因为靶标的siRNA，体外导入肺癌多药耐药细胞，使肺癌耐药治疗达到最佳效果。通过采用脂质

16、体将以MRP、bcl-2基因为靶标的siRNA分别或联合转入肺癌耐药细胞株，发现以MRP为靶标的siRNA明显抑制MRP蛋白和mRNA的表达，同时MRP-siRNA也协同以bcl-2为靶标的siRNA对bcl-2蛋白和mRNA表达的抑制，增加肺癌细胞药物敏感性，耐药基因siRNA为成功逆转肺癌耐药提供全新的有效治疗途径。 (三) 中医药逆转耐药      中西药的联合应用明显改善肺癌临床缓解与生存期，与单一化疗相比有明显的优势。例如汉防己甲素具有膜调节作用，其逆转MDR的机制与其干扰膜的功能，直接与P-gp结合有关，并通过拮抗钙离子对蛋白激酶C的激活，从而抑制蛋白激酶C对MDR1基因的活化P-gp的过度表达，减少抗癌药物从肺癌细胞内的排出，逆转多药耐药性，恢复化疗药物的抗癌功效。实验表明汉防己甲素可以逆转耐药肺癌细胞对阿霉素明显耐药，下调化疗耐药肺癌细胞MRP蛋白表达，协同阿霉素增强对化疗耐药肺癌细胞凋亡作用。同时遵循肺癌中医辨证施治及临证经验，以肺癌化疗耐药细胞株和裸鼠肺癌模型为研究对象，线粒体相关信号传导通路、多药耐药基因表达及提高化疗疗效为切入点，研究益气养肺治法及其方药对肺癌细胞线粒体通透性、氧化磷酸化功能调控、细胞色素C及半胱天冬蛋白酶Caspases活化，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP激活和