酵母双杂交系统的改进与研究进展_图文

1、2006年海洋湖沼通报Transactions of Oceanology and LimnologyNo1文章编号:100326482(20060120108209酵母双杂交系统的改进与研究进展3张莉1,2,黄倢13(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071;2.莱阳农学院植物保护系,青岛266109摘要:酵母双杂交系统是一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用以及筛选cDNA文库的技术手段,自建立以来得到了不断的改进与发展。在此基础上又相继出现了单杂交、三杂交、反向双杂交以及SOS富集系统等多种衍生系统,它们在功能基因组学、蛋白质组学以及药物开发研究中发挥了重要作用。本文拟就双杂

2、交系统的原理、改进、发展及应用做一综述。关键词:酵母双杂交系统;单杂交系统;三杂交系统;反向双杂交系统;SOS富集系统中图分类号:TQ920.1文献标识码:A随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成,基因工程领域又迎来了一个新的时代功能基因组时代,它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作是与蛋白质之间的相互作用密不可分的,如DNA合成、基因转录启动、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。酵母双杂交系统(yeast two2hybrid

3、 system是用于研究蛋白质之间相互作用的一种崭新的、有效的遗传学方法。是由Fields和Song1在1989年首创的,它利用转录启动报告基因,以已知功能蛋白作为“诱饵蛋白”(Bait Protein,从相应的cDNA文库筛选出与之相互作用的蛋白,而不需要蛋白的纯化,比以往研究蛋白质之间相互作用的生化技术如偶联、免疫共沉淀以及亲和层析等更具有优越性。经过十多年的发展,国外学者又创立了基于双杂交原理的新系统如单杂交系统、三杂交系统、反向双杂交系统以及核外双杂交技术等,使人们对研究生物大分子之间的相互作用扩展到蛋白质与核酸之间以及核酸与核酸之间。其功能也被推广到细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表

4、达等多个研究领域,它在水产养殖病害防治中也得到了越来越广泛的应用。1酵母双杂交系统的基本原理酵母双杂交系统的产生是基于对真核细胞转录启动因子如酵母转录因子GAL4性质的研究。其原理如图11所示:Gal4蛋白可识别专一的位点UAS G(up st ream activation se23基金项目:国家重点基础研究发展规划项目课题资助(G1999012002、国家自然科学基金项目(30271020、青岛市自然科学基金项目(03222J ZP210、山东省自然科学基金项目(Q2002D02和中国水产科学研究院科研基金项目(20032青26共同资助3通讯作者:黄倢,博导,研究员。从事海洋生物病毒学研究

5、Tel:0532-*E2mail:aqudis2000 第一作者简介:张莉(19732,女,硕士研究生,主要从事分子病毒学研究收稿日期:2005203202quence并与之结合,启动下游GAL12lacZ基因的转录。GAL4在结构上是组件式的(modu2 lar,由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域组成。其N末端1147个氨基酸构成DNA结合结构域(Binding Domain,BD,单独的BD不能启动下游靶基因的转录,而当它与靶基因启动子内特异的核苷酸序列结合后即能激活基因的转录。其C末端由768 881个氨基酸构成DNA激活结构域(Activating Domain,AD,

6、它只有结合到UAS G上才具有启动转录的功能。这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系使得它们只要在同一细胞内就能彼此靠近,启动下游报告基因的表达。根据这一特点,使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS结合,进而发挥启动转录的功能,使受调控的报告基因得以表达。在目前通用的系统中,根据BD来源不同可分为GAL4系统和LexA系统。真核细胞中的是GAL4系统;原核细胞中的是LexA系统,其转录启动因子是LexA。Fields1等以与调控SUC基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型设计了一个检测蛋白-蛋白相互作用

7、的双杂交系统,将Snf1与BD融合,Snf2和AD融合,构建在穿梭质粒上。Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶,Snf2是其结合蛋白,把两种穿梭质粒转化酵母GGY:171菌株,该菌株含有LacZ报告基因,并且已去除了相应的转录因子基因,此结果表明由Snf1和Snf2的相互作用使AD和BD在空间上相互靠近,从而启动报告基因LacZ的转录。利用此原理,我们可构建两个重组质粒,将感兴趣的蛋白基因转入带有BD结构域的质粒载体中,并把其转入酵母细胞中表达一个融合蛋白诱饵蛋白(bait;把要筛选的cDNA文库转入带有AD结构域的另一质粒载体中,表达另一个杂交蛋白靶蛋白(prey;然后共转化酵母菌或

8、者是通过两个单倍体酵母菌融合,转化的酵母菌株应该带有一个或多个报告基因,常用的报告基因有H IS3,L ACZ,AD E2和U RA3等,转化的菌株则具有相应的缺陷型。在选择性缺陷培养基上筛选,通过对报告基因表型的鉴定来确定2个蛋白是否存在相互作用。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因,这样有利于转化后质粒的筛选和鉴定。依靠简便的酵母遗传分析以及对报告基因表型的检测就可用来研究蛋白质之间的相互作用 。a:完整的GAL4蛋白,既能结合UAS,又能启动转录,报告基因打开。b:单独的BD和AD分别具有功能,但由于无法启动转录或正确定位,报告基因关闭。c:BD及AD双杂交上X和Y蛋白后的大

9、体系又恢复结合UAS及启动转录功能,报告基因打开。图1酵母双杂交系统原理图Fig.1The principle of yeast two2hybrid system 9011期酵母双杂交系统的改进与研究进展011海洋湖沼通报2006年2酵母双杂交技术的应用研究现状及其局限性酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术平台,近几年来得到了不断的应用和发展,它已被广泛应用于分子生物学的各个领域中。主要有以下几个方面:(1发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。双杂交系统最为重要的用途就是从cDNA文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白,从而研究蛋白间相互作用的传递途径。目前已经

10、利用该系统对HBV、HCV以及H IV等多种病毒蛋白基因的相互作用蛋白进行了研究2。Engelender5等人以神经末端蛋白alp ha2synuclein蛋白为诱饵蛋白,利用酵母双杂交CLON2 TEC H MA TCHMA R KER S YSTEM3为操作平台,从成人脑cDNA文库中发现了与alp ha2 synuclein相互作用的新蛋白Synp hilin21,并证明了Synp hilin21与alp ha2synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病密切相关。(2非常灵敏地检测或验证蛋白蛋白的相互作用。如Aelst等3用双杂交技术检测出用免疫沉淀法无法检测到的RasRaf之间的

11、相互作用。李凌云4利用酵母双杂交技术证实了bip是位于绒猴2B类淋巴母细胞中麻疹病毒新的细胞受体基因。(3可利用酵母双杂交筛选药物的作用位点,寻找基因治疗中的多肽类药物。利用双杂交系统可以确定治疗所用的多肽类药物与来源于肿瘤、细菌以及病毒的蛋白质间的相互作用。逆向双杂交技术在药物筛选中的作用更为广泛。(4在蛋白质组学研究中的应用:可利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图谱(Genome Protein Linkage Map。Walhout6等以线虫的生殖发育过程为研究对象,利用已知的27个线虫发育相关蛋白建立了一个大规模的双杂交系统,结果得到了100多个相互作用的蛋白。Bartel等7通过cDN

12、A的随机表达找到了25个相互作用的蛋白,且发现有6个交互作用是两两相连的。(5研究蛋白蛋白间发生相互作用所必需的重要活性位点。在确定两蛋白存在相互作用后,要对所研究的蛋白做一系列缺失突变处理,通过缺失掉不同片段来对蛋白中起关键作用的功能域进行精确的定位。K iston等17利用双杂交系统研究了TN F2R家族的细胞表面受体,结果发现它们存在一个由7080个氨基酸构成的保守域,又称之为“死亡区域”。它是引发了细胞凋亡(apoptosis的重要信号之一,并同时发现了一个新的具有“死亡区域”的TN F2R族的表面受体WSL21蛋白(DR3/A PO23。传统的研究蛋白质相互作用的方法如交联、免疫共沉

13、淀、亲和层析等均是采用体外实验(in vit ro进行的,它受到环境、实验条件等多种因素的影响。而双杂交系统则是采用体内实验(in vivo,不易受外界环境的影响,而且所有操作均在核酸水平上进行,不需要蛋白质的大量纯化就可以检测到蛋白间微弱的相互作用。但是该系统也存在一定的局限性:(1“假阳性”是双杂交系统首要考虑的问题。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用,使p rey2BD融合基因与bait2AD融合基因表达产物无需特异结合,就能启动转录系统。或者某些蛋白的表面有对其它蛋白的低亲和力区,易形成蛋白体复合物,也可引起报告基因的表达,使酵母出现相应表型,产生假阳性结果

14、。(2所分析的可能存在相互作用的蛋白必须定位于核内,才能激活报告基因,但很多蛋白的相互作用依赖于翻译后加工,如二硫键的形成等要在胞浆内完成。因此有些蛋白就不能采用该方法。假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题。3酵母双杂交系统的改进与发展3.1酵母单杂交系统(One 2hybrid system 酵母单杂交系统是Li 等18,19根据双杂交技术的原理提出的,用于研究DNA 2蛋白质之间的相互作用。其原理如图2所示9:AD 和某个DNA 结合蛋白(DNA binding p rotein ,DNA bp 的基因(该基因来源于某cDNA 文库融合于同一质粒载体,在报告基因的上游至少有3个串联

15、的DNA bp 结合位点(E ,DNA bp AD 融合蛋白将识别其结合位点并与之结合,AD 就启动了下游报告基因的转录。单杂交系统与双杂交系统的区别在于前者把要研究的DNA 序列置于报告基因上游,以这段特异性的DNA 序列为诱饵,去筛选cDNA 文库编码的靶蛋白,不需要BD 2X 的参与12;而后者是用诱饵蛋白来筛选与之结合的蛋白。Li 等16利用单杂交系统成功地筛选到与HBV EN (相结合的转录因子hB IF 。单杂交系统提供了最大程度的灵敏性,因为蛋白在保持本来结构的同时就能利用该系统监测到它们之间的相互作用,并且在文库筛选以后能立即得到我们感兴趣的基因编码的蛋白10。单杂交系统在细胞

16、信号转导以及基因调控等功能研究中有重要作用。DNAbp 的基因与AD 构建成融合蛋白,与上游特异性识别位点结合后,AD 启动下游报告基因的转录。图2酵母单杂交系统原理图Fig.2The principle of yeast one 2hybrid system 3.2三杂交系统(Three 2hybridsystem 近几年来,随着双杂交技术的广泛应用,Sen Gupta 33在此基础上又发展了酵母三杂交系统,它的应用范围比双杂交系统更加广泛。它也是利用酿酒酵母细胞的GAL4蛋白调节半乳糖苷酶基因转录的特点,其主要特征是两个融合蛋白在空间上的靠近需要第三个分子的参与,第三分子可以是蛋白质、激酶

17、、多肽、DNA 、RNA 或小分子配体等。它们可通过修饰诱饵蛋白或靶蛋白使二者发生相互作用,或者诱导二者使其发生构象改变后产生相互作用,进而启动报告基因的表达。其本质与双杂交系统是相同的,但是该系统需要第三个分子的介导把两个杂交蛋白结合在一起11。其基本原理如图3所示:诱饵蛋白X 和DNA BD 融合,靶蛋白Y 和转录结构域AD 融合,蛋白质X 和Y 由于第三个分子Z 的介导从而导致AD 和BD 在空间上接近,启动了下游报告基因的表达。根据第三个分子的成分不同可分为:蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、RNA 三杂交系统和小配体三杂交系统。蛋白质三杂交系统29:该系统中诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用

18、必须依靠第三种蛋白Z ,Z 使二者发生作用或者诱导蛋白质发生构象变化,从而促使二者稳定结合。激酶三杂交系统30:该系统可用来研究需翻译后加工的蛋白。利用酪氨酸蛋白激酶将其中一种蛋白质在特定位置上的酪氨酸磷酸化,磷酸化后的蛋白才能与另一种发生相互作用,当然还可引入多种翻译后修饰因子如甲基化酶、糖基化酶来研究需翻译后修饰的蛋白质的相互作用。RNA 三杂交系统13:该系统用来研究RNA 与蛋白质的相互作用,BD 2Bait 和AD 2Prey 不能直接发生1111期酵母双杂交系统的改进与研究进展作用,但Bait 可通过与一种RNA 分子的部分序列结合,来检测该RNA 分子的其他序列与未知蛋白Prey

19、 的相互作用。此外还有多肽三杂交系统31和小配体三杂交系统32。在对免疫抑制剂F K506的研究中,主要应用了小配体三杂交系统。Belshaw 等15将免疫抑制剂F K506与环孢菌素A (Cyclo sporin A 构建成异源二聚体,此二聚体介导了诱饵和靶蛋白之间的相互作用。K icitra 等22将F K506与地塞米松(Dexamet hasone 合成杂交分子后,作为诱饵蛋白(糖皮质激素受体与BD 的融合蛋白的配体,从与AD 融合的靶蛋白cDNA 文库中成功地筛选出F K B P12蛋白。Putz 等21把HIV 21病毒的Rev 蛋白突变体RevM10与DNABD 融合,构建成诱饵

20、蛋白,利用RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA 中的Rev 蛋白反应成分,筛选同样能与该RNA 结合并与DNA 2AD 融合的蛋白。三杂交系统在信号转导中起重要作用,其应用范围比双杂交系统广泛,但对于在超过3种成分更为复杂的相互作用则无能为力。在对蛋白质2药物小分子的相互作用研究中,药物小分子要能透入酵母细胞膜,对不能透入细胞膜的药物小分子该方法不适用;并且适用于可溶蛋白,不能用于膜结合型蛋白的研究。图3酵母三杂交系统原理图Z:介导蛋白质相互作用的第三个分子,可以是蛋白质,核酸或小分子配体Fig.3The principle of yeast three 2hybrid system Z:T

21、he third molecule which mediates the protein 2protein interaction ,which can be protein ,nucleic acid or ligand 3.3反向双杂交系统(Re 2verse two 2hybrid system 在对蛋白质中有重要作用的功能域、作用位点以及影响蛋白质结合或解离因素的研究中,反向双杂交系统发挥了重要作用。它最早是在1996年由Vidal等20提出的。该系统采取反向选择筛选的方法,最大的特点就是将蛋白质之间的解离作用变为一种选择优势。其关键在于逆向报告基因的引入,常用的报告基因有3种即U R

22、A3,C YH2和L YS2。当野生型BD 2X 与AD 2Y 间发生相互作用时,启动了毒性报告基因的表达,它对酵母菌株有毒性或者是致死的。当二者解离时毒性报告基因不能表达,菌株具有生长优势。不同的毒性报告基因都可用来提供阴性筛选 。图4反向双杂交系统基本原理示意图AFig.4The principle of reversetwo 2hybrid system (A 图5反向双杂交系统原理示意图B Fig.5The principle of reverse two 2hybrid system (B 211海洋湖沼通报2006年1期 酵母双杂交系统的改进与研究进展 113 在反向双杂交系统中

23、,一类是采用反选择性报告基因如 U RA3 或者 C YH2 ( 如图 4 23 。 U RA3 基因编码尿嘧啶合成途径中起重要作用的酶 乳清酸核苷252磷酸脱羧酶 ,它把 52氟乳 清酸 ( 52FOA 转变为毒性物质 , 使细胞不能生长 。相反 , 如果融合蛋白的相互作用被阻断 , U RA3 基因不表达 ,酵母菌则表现为生长 。在以 C YH2 作为报告基因的体系中 , 野生型相互 作用赋予酵母细胞放线菌素酮 ( 环己酰亚胺 敏感表型 24 。另一类是由 Shin 等 28 在研究分裂 杂合系统时得出的 ( 如图 5 23 : 用大肠杆菌转录抑制子 Tet R 作为报告基因 ,并在原有报

24、告基 因 ( 如 H IS3 的上游引入一个 Tet R 产物结合位点即 Tet 操纵基因 ,当待测蛋白发生相互作用 时启动了 tet2R 基因表达抑制子 Tet R ,它结合 tet 操纵子后就抑制了报告基因 H IS3 的表达 , 结果转化子不能生长 。反之 , 当待测蛋白之间的相互作用被阻断时则无法启动 tet2R 基因 , H IS3 就不受 tet 操纵子的控制而表达 。Shih 等 25 利用该方法鉴定了 cAM P2应答组件结合蛋 白中磷酸化位点的 Ser133 突变会阻断其与辅助启动因子的相互作用 。此外 ,Brachmann 34 等 还提出了反式单杂交系统 ,并已成功分离鉴

25、定了 p53 突变体 。 反向双杂交系统可以鉴定作用缺陷等位基因 、 解离肽或相关的小分子物质 ,它在研究蛋白 质间的作用位点 、 蛋白质与 RNA 、 蛋白质与药物小分子 、 癌症以及蛋白质组学中发挥着越来越 26 重要的作用 ,在药物筛选中有着更广阔的应用前景 。 3. 4 核外双杂交系统 上述几种技术对于相互作用的检测是基于对报告基因转录的基础上 ,但是对于一些有自 激活作用的不适用于双杂交筛选的诱饵蛋白 ,以及大量的非核内蛋白质如细胞外分泌蛋白 、 膜 27 受体蛋白等的研究 , 就需要建立一个非转录基础上的双杂交筛选体系 。Aro nheim 等 在 1997 年构建了 SOS 蛋白

26、招募系统 ( So s Recruit ment System 把蛋白质相互作用的场所从核内 转移到酵母的细胞膜上 ,它通过应用 2 个蛋白相互作用后对 Ras 信号通路的恢复作用而取代 传统的转录激活机制 ,克服了传统双杂交系统的一些局限性 。 SOS 蛋白招募系统的基本作用原理如下 : 在正常情况下 , 当有生长信号刺激时 , 酵母的 Ras 鸟苷酸交换因子 ( Ras guanyl nucleotide exchange factor , R GEF Cdc25 会富集到细胞膜 上 ,此时 Cdc25 能够促使 Ras 蛋白的 GD P 与 GTP 的交换 , 激活下游的信号 , 使酵母

27、细胞生 长 。在酵母温度敏感缺陷株 cdc2522 中 ,cdc25 由于突变丧失了上述功能 , 使得此菌株只能在 25 下生长 ,而在限制温度 37 无法生长 。如人为地引入正常的 GEF ( SOS 蛋白 , 并使得 C C GEF 与 Ras 蛋白足够接近 ,则可弥补这一缺陷 。将待测蛋白 X 与哺乳动物细胞的鸟苷酸交换 因子 ( GEF So s 蛋白融合 ,将 Y 蛋白与锚定于酵母细胞膜上的 Src 信号蛋白融合 ,使它们共表 达于一个 cdc2522 基因敏感型突变的酵母菌株内 。 Y 被定位在细胞膜上 ,蛋白 X 与 Y 发生相 互作用使 SOS 因子作用于细胞膜上 Ras 蛋白

28、 ,激活了 Ras 途径 ,从而细胞能在 37 生长 。 C 8 Ko 等 利用该系统以甲状腺素受体 (21 的配基结合结构域为诱饵蛋白 , 筛选到甲状腺素 温度下生长 ,从而出现假阳性结果 。为了去除假阳性 , Huang 14 等设计了一对 Ras 基因特异 引物 ,在筛选过程中增加了一步 PCR 反应 ,这样可有效去除哺乳动物 Ras cDNA 造成的假阳 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 的一个受体结合蛋白 - TRB P 。Aro nheim 等人利用该

29、技术找到了 c2J un 的两个新的作用伙 伴。 SOS 蛋白招募系统的主要优点在于被研究蛋白质的相互作用是发生在细胞质而不是细 胞核 ,因此其应用范围更加广泛 ,但同时也存在一些假阳性问题 : 在筛库过程中如果存在 Ras 信号通路中的 Ras GTPase 家族成员的 cDNA ,则可能激活下游的信号通路 ,酵母便会在限制 114 海 洋 湖 沼 通 报 2006年 性 。 Aro nheim 36 利 用 哺 乳 动 物 的 GA P ( GTPase activateing p rotein 抑制并减少假阳 性。 3. 5 哺乳动物双杂交系统 酵母菌属于比较低等的真核生物 , 对于蛋

30、白质翻译后的加工修饰如糖基化 、 甲基化 、 磷 酸化以及二硫键的形成等修饰水平很低 ,要进 一步研究蛋白的功能就需要建立高等生物的 双杂交系统 ,如在哺乳类细胞中进行相互作用 检测 。哺乳动物双杂交系统能够检测那些相 互作用依赖于蛋白翻译后修饰的蛋白质 35 。 其原理和酵母双杂交系统相同 ,把编码诱饵蛋 白和靶蛋白的基因克隆到相应的载体上 ,采用 磷酸钙共沉淀转入 Hela 等哺乳动物细胞中培 养 ,当二者发生相互作用时 ,激活了报告基因 , 可通过报告基因的表达产物进行检测 。 图 6 SOS 核外双杂交系统原理图 Fig. 6 The p rinciple of SOS ult ra2

31、nucleus two2hybrid system 4 结 语 酵母双杂交技术在研究蛋白质之间的相互作用方面发挥了重要作用 ,在水产养殖病害防 治中同样有重要的应用价值 。当某一种海洋病毒吸附宿主的病毒粘附蛋白确定以后 , 即可构 建宿主靶细胞的 cDNA 文库并以该粘附蛋白做为诱饵蛋白 ,利用双杂交系统从文库中 “钓” 取 与之相互作用的蛋白 。 综上所述 ,随着现代科学技术的不断进步 ,酵母双杂交系统正得到不断地完善和发展 ,人 们将设计出更多更巧妙的相互作用陷阱来获取新的未知蛋白和未知基因 ,为进一步探讨有关 疾病的发生机理和治疗措施以及开发新型药物等方面提供更有价值的理论依据 。正如人

32、类基 因组计划曾经给生物学家带来巨大的希望一样 ,酵母杂交体系将给人们提供另一获得大量生 物学信息的途径 ,该体系的不断完善和发展 ,必将在蛋白质组学以及基因组学研究中发挥越来 越重要的作用 。 参考文献 : 340 :245246 1 Fields , S. , and So ng , O. A novel genetic system to detect p rotein2p rotein interactio ns. Nat ure , 1989 , 4 李凌云 刘鑫 齐义鹏 等 麻疹病毒绒猴细胞受体基因的克隆及功能鉴定 J . 科学通报 ,2002 ,47 (16 : 12172122

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47、报 2006年 p rotein interactio ns and screening cDNA libraries. It has been imp roved and developed since it s original descriptio n. Recently , many new research techniques have been developed in or2 playing an important role in t he research of geno mics , p roteo mics and medicine exploitatio n. Thi

48、s paper summarizes it s t heo ry , imp rovement , develop ment and applicatio n. tem , rever se t wo2hybrid system , SOS recruit ment system and ot her derived systems. It is SOS recruit ment system Key words : Yeast t wo2hybrid system ; Yeast o ne2hybrid system ; Yeast t hree2hybrid system ; 1994-2

49、009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. der to widen t he t raditio nal system , such as yeast o ne2hybrid system , yeast t hree2hybrid sys2 Abstract :The yeast t wo2hybrid system is a powerf ul technique for detecting in vivo p rotein2 26 Vidal M , Endo h H. Pro

50、 spect s fo r drug screening using t he reverse two2hybrid systemJ . Trends Bio2 27 Aronheim A , Zandi E , Hennemann H , et al. Isolatio n of an A P21 rep ressor by a novel met hod for de2 28 Shin HM , Goldman PS , DeMaggio AJ , Hollenberg SM , Goodman R H , Howkst ra M F : Apo sitive ge2 29 Zhang J , Lautar S. A yeast t hree2hybrid met hod to clone ternary p rotein complex co mponent s J . A2 30 Osbo rne MA , Dalton S , Kochan J P. The yeast t ribrid system2genetic detection of t rans2p ho sp ho rylated 32 Licit ra E J , Liu J O. A t hree2hybrid system fo r d