组织工程医疗器械产品壳聚糖

1、组织工程医疗器械产品壳聚糖1范围本标准规定了用于制备组织工程医疗器械产品的壳聚糖及其盐的要求、试验方法等，本标准适用于 制备组织工程医疗器械产品的壳聚糖及其盐，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 191包装储运图示标志GB/T 16886. 1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T 16886. 7医疗器械生物学评价第1部分：环氧乙烷灭菌残留量GB/T 16886. 12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品GB

2、 18278. 1医疗保健产品灭菌湿热第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求GB 18279. 1医疗保健产品灭菌环氧乙烷第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制的 要求GB 18280. 1医疗保健产品灭菌辐射第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求YY/T 0313医用高分子制品包装、标志、运输和贮存YY/T 0771. 1动物源医疗器械第1部分风险管理应用YY/T 0771.2动物源医疗器械第2部分：来源、收集与处置的控制YY/T 0771. 3动物源医疗器械第3部分：病毒和传播性海绵状脑病（TSE）因子去除与灭活的确认中华人民共和国药典（2015年版）

3、3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1壳聚糖chitosan由2-经基-2-脱氧-D-毗喃葡萄糖（GlcN）和2-乙酰皴基-2-脱氧-D-唯喃葡萄糖（GlcNAc）通过B （1-4）连接而成的线性多糖，其结构式为：3.2脱乙酰度degree of deacetylation一个壳聚糖分子中葡萄糖胺单元（脱乙酰基的单元）的摩尔分数。4分类按照是否与酸结合，可分为壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乙酸盐、壳聚糖谷经酸盐和壳聚糖乳酸 盐。5动物源性材料要求动物组织中提取制备的壳聚糖及其盐应按照YY/T0771. 1、YY/T0771. 2、YY/T0771. 3的要求进行管 理和控制。6要求6.

4、1 性状类白色或淡黄色粉末状、丝状或片状的固体，无臭。6.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）壳聚糖或壳聚糖盐傅里叶变换红外光谱应符合相应的特征峰，宽峰（b）数值偏差不大于150 cm-1, 其他峰数值偏差不大于20 cm'壳聚糖或壳聚糖盐典型的FT-IR频率（cnT）如表1所示：表1傅里叶变换红外光谱主要特征峰基团壳聚糖壳聚糖乙酸盐壳聚糖盐酸盐壳聚糖谷氨酸盐壳聚糖乳酸盐特 征 峰V (O-H)+U (N-H )3447 (b)3362 (b)3344 (b)3120 (b)u (C-H)29292934v (C=O)较基1736u (C=O)酰胺I带16526 (NHJ16056 (

5、N-H) + u (C-N)酰胺n带155615131555 <b)15916 (CH2)+6 (CHj)110614586 (CHc)+6.(CH5)1380137913961381u (C-O)1153115111546 (C-O-C)1070 (s)1083 (s)1086 (s)1085 (s)1086(s)注：S：强峰：b：宽峰C6.3 含量以干燥品计算，壳聚糖或其盐的含量应不小于85机6.4 脱乙酰度应为标示值的90 %110 %o壳聚糖检测液的pH值应为5. 08. 0：壳聚糖盐检测液的pH值应为4. 06. 0,6.6 动力黏度在20C时壳聚糖的动力黏度不得超过标示量的8

6、0 %120机 注：以mPa. s或Pa. s为单位标明黏度。6.7 重均分子量及分子量分布壳聚犍或其盐重均分子量和分子量分布（而；/而；）由制造商确定。6. 8重金属含量重金属含量（以Pb计）应不大于10ug/g （质量分数）。6.9蛋白质含量壳聚糖蛋白质残留量应不大于0.2 %（质量分数）。6. 10乙醇等有机溶剂残余量乙醇残余量应不大于0. 5 % （质量分数）。注：如在加1：过程中使用除乙醇之外的其他有机溶剂，应建立相应的检验指标和检验方法。6.11 干燥失重应不大于10%（质量分数）。6.12 炽灼残渣应不大于1.0%（质量分数）。6. 13不溶物应不大于0.5 % （质量分数）。6

7、. 14神盐不得过百万分之一。6. 15细菌内毒素含量每1.0 mg壳聚糖或其盐细菌内毒素含量应小于0. 05 EUo注：如果以非无菌的方式提供，则最终用户需进行去除细菌内赤素的处理以达到细菌内而素限量要求。6. 16无菌试验应无菌。如果壳聚糖或其盐以无菌方式提供，应进行该项目的检测，并按照GB18278. 1、GB18279. 1、 GB18280. 1进行无菌工艺确认。如果采用环氧乙烷灭菌，还应按照GB/T16886. 7对其残留量进行控制和检 测。6. 17微生物限度每克（g）供试品中需氧菌总数小于100 cfu,霸菌和酵母菌菌落数小于20 cfu,不得检出金黄色葡 萄球菌、铜绿假单胞菌

8、和大肠埃希菌。注：如果壳聚糖或其盐以非无菌的方式提供，则进行该项目的检测。6.18生物学性能应按照GB/T 16886. 1的要求对壳聚糖及其盐进行生物学评价。7试验方法7.1 性状肉眼直接观测，应符合6.1规定。7.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）按照中华人民共和国药典（2015年版）四部，通则0402,红外分光光度法规定的方法测定，应符 合6. 2规定。注：用滨化钾压片作为仲裁方法。7.3 含量按照附录A的方法测定，应符合6. 3规定。7.4 脱乙酰度7. 4.1脱乙酰度可采用以下方法测定，但不限于以下方法，应符合6. 4规定。7. 4.2壳聚糖盐样品的制备称取约2g壳聚糖盐，置烧杯中

9、，加乙醉100 mL,边搅拌边滴加10%氢氧化钠溶液，至pH值大于8。 过滤，用水洗涤沉淀物至洗出液呈中性，50C干燥4小时，再于105干燥至恒重，作为供试品。7. 4.3脱乙酰度测定-酸碱滴定法准确称取在105下干燥至恒重的样品0.2 g0.3 g,置于2501nL锥形瓶中，加入0. 1 mol / L的盐酸 滴定液30mL,在2025C下搅拌至完全溶解（可加入适量水稀释）。加入甲基橙一苯胺蓝（将0.1% 的甲基橙水溶液和0. 1 %苯胺蓝水溶液以1 ： 2体积比混合）指示剂56滴，用氢氧化钠滴定液（0. 1 mol /L）滴至红色退去。按式（1.1）和式（1.2）计算：（CX-CJJxlO

10、-xiG x wo%（L1）mD D= 203 xp x I。*（1.2）16 + 42 x p式中：p一一样品中织基含量，%;G一一盐酸滴定液的浓度，单位为摩尔每升，mol/L：匕一一盐酸滴定液的体积，单位为亳升，mL：C,一一氢氧化钠滴定液的浓度，单位为摩尔每升，mol/L；V,氢氧化钠滴定液的体积，单位为亳升，mL；16氨基的相对分子质量；劭一一样品质量，单位为克，g:D.D样品的脱乙酰度，%：7.11干燥失重203N-乙酰氨基-D-前萄糖结构单元相对分子质量: 42乙酰基的相对分子质量。7. 4.4脱乙酰度测定一双突跃电位滴定法:准确称取在105下干燥至恒重的样品0.2 g0.3 g,

11、加入过量的0. 1 mol/L盐酸滴定液，搅拌至完 全溶解。然后在电位滴定装置上用氢氧化钠滴定液滴定，氢氧化钠滴定液首先中和过量的HC1, pH值出 现急剧上升，即第一个突变，然后氢氧化钠滴定液再中和与壳聚糖的氨基结合的盐酸，达到滴定等当点 时，pH出现第二个突变，两个突跃点消耗的氢氧化钠摩尔数相当于样品中的级基摩尔数。按式（2.1） 计算：D.D (%)=Vxc xl°7xl6m x 0.0994(2.1)式中：D.D一一样品的脱乙酰度，%：AV两突跃点之间消耗的氢氧化钠滴定液体积之差，单位为亳升，mL； 一一氢氧化钠滴定液的浓度，单位为摩尔每升，mol/L：好一一样品质量，单位为

12、克，g:16氨基的相对分子量；0. 0994一理论氨基含量。以方法7. 4. 4为仲裁方法。7.5 pH 值取壳聚糖盐，用纯化水制成lOmg/mL的溶液，搅拌溶解，制备检测液：取壳聚糖，以10 mg/mL的比 例加入纯化水，在37°C±1'C于密闭容器中浸提24h,制备检测液，按照中华人民共和国药典（2015 年版）四部通则0631 pH值测定法测定，应符合6. 5规定。7.6 动力黏度壳聚糖/壳聚糖盐用1舟乙酸溶液/纯化水溶解至浓度为10 mg/mL的溶液，搅拌溶解后，按照中华 人民共和国药典（2015年版）四部通则0633黏度测定法第三法测定，采用旋转式黏度计或

13、流变仪，在 规定的转速和转子号或剪切速率，20±0.5七条件下，应符合6. 6规定。7.7 重均分子量及分子量分布按照附录B规定的方法测定，应符合6. 7规定。7.8 重金属含量按照中华人民共和国药典（2015年版）四部，通则0821,重金属检查法（第二法）测定。若按该 法操作溶液有颜色，可按2015年版四部，通则0821,重金属检查法（第一法）第一段中“若供试液带颜 色”项下进行。应符合6. 8规定。7.9 蛋白质含量按照附录C规定的方法测定，应符合6. 9规定。7.10 乙醇残余量按照附录D规定的方法测定，应符合6. 10规定。按照中华人民共和国药典（2015年版）四部，通则08

14、31,干燥失重测定法，取本品1.0 g,在 105c±2下干燥至恒重，按照干燥后重量与取样量进行计算，应符合6. 11规定。7.12 炽灼残渣按照中华人民共和国药典（2015年版）四部通则0841炽灼残渣检查法，取本品1.0 g进行测定, 应满足6. 12要求。7.13 13不溶物准确称取供试品2.0 g,壳聚糖用集乙酸溶液或壳聚糖盐用纯化水400 mL溶解，待完全溶解后。将 溶液转移至2 L容器中，加纯化水200 mL加热至沸腾并保持微沸2h,加热过程中盖住烧杯口。用砂芯 漏斗（3#）过滤，用水洗涤残留物，100C105c干燥至恒重，按照残留物重量与取样量进行计算， 应符合6. 1

15、3规定。7. 14碑盐取本品2. 0 g,加氢氧化钙1.0 g,混合，加水2 mL,搅拌均匀，置水浴上蒸干，以小火烧灼至炭化, 后以500600C炽灼使完全炭化，放冷，加盐酸5mL,加水23mL,按照中华人民共和国药典（2015 年版）四部，通则0822附盐检查法（第一法）测定，应符合6. 14规定。7. 15细菌内毒素含量壳聚糖用细菌内毒素检查用水浸提或壳聚糖盐用细菌内毒素检查用水溶解，按照中华人民共和国 药典（2015年版）四部，通则1143,细菌内毒素检查法测定，应符合6. 15规定。7. 16无菌试验按照中华人民共和国药典（2015年版）四部，通则1101,无菌检查法测定，应符合6.

16、16规定。7. 17微生物限度按照中华人民共和国药典（2015年版）四部，通则1105,非无菌产品微生物限度检查：微生物计 数法测定，和通则1106,非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法测定，应符合6. 17规定。7.18生物学性能按照GB / T16886. 12规定的方法制备实验样品，按照GB/T16886. 1确定相关生物学评价试验。8标志8.1 大包装应有下列标志a）生产厂名和地址：b）产品名称：c）执行标准编号；d）规格和数量；e）生产批号或日期：0失效日期；g）贮存条件。8.2 小包装应有下列标志a）产品名称：b）生产厂名和地址：c）规格和数量；d）生产批号或日期：e）原料来源：

17、0失效日期：g）贮存条件：h）灭菌方法：i）适用范围。8. 3储运标志应符合GB/T 191中的规定。注：可参考YY 0466.1中所给出的图形符号满足上述要求。9包装、运输和贮存A. 1应采用适宜的包装，确保壳聚糖及其盐产品的安全性和有效性。B. 2产品的包装、贮存、运输应符合YY/T 0313的规定。附录A（规范性附录）含量测定C. 1测定方法按中华人民共和国药典（2015年版）四部通则0704 “氮测定法”第二法（半微量法）规定的 方法进行。A.2结果计算壳聚糖含量按照公式A1和A2 （壳聚糖及其一元族酸盐）、A3 （壳聚糖二元竣酸盐）计算:<V,-VfA）xCx2xl4N = .

18、 -L P AlIV=. A，x V xl（X）%A214x1000和二2 '”x 100%14 x (2 + DD%) x 1000式中：N待检样品中的总氮含量，单位为毫克每克，mg/g；M一待检样品质量，单位为克，g:F待检样品中水分含量，%；VI样品管消耗标准硫酸溶液体枳，单位为亳升，mL；VO空白管消耗标准硫酸溶液体枳，单位为亳升，mL；r标准硫酸溶液的浓度，单位为摩尔每升，mol/L；那一一壳聚糖含量，%;14氮原子质量：方一一理论条件下，壳聚糖或其盐单元平均分子量。壳聚糖或壳聚糖盐单元平均分子量计算式：壳聚糖及其一元段酸盐：203-42XDD%+A/XDD% A4壳聚糖二元

19、竣酸盐：203-42X DD%+1 /2XMXDD% A5式中：-壳聚糖盐的竣酸根摩尔质量（壳聚糖：0；盐酸盐：36. 5；乙酸盐：60：乳酸盐：90：谷皴酸盐（GHsNOi） ： 147）：DD%一一壳聚糖或其盐的脱乙酰度，注：而应根据壳聚糖或其盐的脱乙酰度的不同给定。附录B（规范性附录）重均分子量及分子量分布系数测定D. 1原理光散射法是测定高聚物绝对分子量的方法。高分子溶液可视为不均匀介质，当光通过它时，入射光 就会发生散射。其散射光强度远高于纯溶剂，并且与高聚物的分子量链形态、溶液浓度、散射光角度和 折光指数增量（dn/dc）密切相关。因此由光散射法测得不同浓度（C）的高聚物溶液在不同

20、散射角（0 ） 下的散射光强（10）数据后，即可求得其重均分子量（Mw）等。若要得到分子量分布系数，可采用激 光散射-凝胶渗透色谱联用法（LLS-GPC）。4.2 设备分析天平、激光散射仪、示差检测器、HPLC泵、柱温箱、保护柱、线性柱（TSKG6000PHXLYP）或 相关色谱柱、1.0 mL进样环。4.3 溶液制备1）流动相（推荐）0. 25 M乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.5, 0.2%。叠氮化钠）：准确称取乙酸钠205g,叠氮化钠2. 0 g, 用冰乙酸调pH值至4. 5,加蒸僧水溶解并稀释至10 000 mL,并用0. 45 Rm的滤膜过滤。2）样品制备准确称取供试品适量，用上述流动

21、相溶解并稀释至适宜浓度，用0.22 Mm过滤器过滤。3）样品制备（dn/dc测定）准确称取供试品适量，用上述流动相溶解并稀释至适宜浓度，再用流动相按照1:5、2:4、3:3、4:2、 5:1的浓度比进行梯度稀释，配制成6个不同浓度的系列样品，用0.22阿过滤器过滤。4.4 步骤 1）折光指数增量（dn/dc）：用流动相清洗后的进样器，依次从低浓度到高浓度抽取适量样品，注入示 差检测器，在基线出现平行时采集数据1分钟，通过仪器系统测定出dn/dc。2）将色谱柱与激光散射仪和示差检测器连接，流动相冲洗至基线平稳后，取适量样品溶液进样，在规 定流速、色谱柱温度条件下检测样品的分子量及分子量分布。4.

22、5 结果计算检测完毕后，通过仪器配套的色谱分析软件确定样品的峰面积，输入dn/dc值，根据软件要求设置 其他相关参数，计算分子量及分子量分布系数并输出报告。注1 ：同一物质在同一溶剂下的折光指数增量为一恒值。注2：可采用凝胶色谱法，但应予以验证并在报告中说明。附录C（规范性附录）蛋白质含量测定E. 1原理考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue） G-250具有两种色调，在游离状态下呈红色，与蛋白质 结合后转为青色，蛋白质与染料结合物在595nm处有最大光吸收，且吸光度与蛋白质含量成正比，可用 比色法测定。C.2设备1）分析天平2）紫外分光光度计3）旋涡式混合器C.3溶液制

23、备1）考马斯亮蓝G-250试液：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶解于50mL的95%乙醇中，再加入浓盐 酸50 mL,并用水稀释至1000 mL,混匀。过滤，取滤液，置于棕色瓶内，室温贮存。如有沉淀产生， 使用前过滤。2）蛋白质标准液（30ng/mL）：精确称取牛血清白蛋白对照品，用水稀释成约300 ug/mL作为储 备液，4下贮存。临用时，用居乙酸稀释成约30 口 g/mL。注：实验所用试剂均为分析纯。C.4样品准备准确称取供试品约50 mg,用集乙酸溶解并稀释，制成5 mg/mL的溶液。精密量取1 mL置样品管中， 以供检查。注：由于高分子里壳聚糖的紫凝作川，与考马斯亮蓝会产生沉淀

24、，影响检测结果，在样品溶解后应置于80c中恒温 4小时或其他可降解壳聚糖但不影响蛋白结果的处理方式进行样品处理。C.5测定步骤1）按下表制备蛋白质标准液：表C1蛋白质标准溶液系列浓度试管号01345蛋白质标准溶液，mL00.10.20.40.81.01 %乙酸溶液，mL1.00.90.80.60.20蛋白质浓度，u g/mL0361224302）在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入5 mL的考马斯亮蓝G-250溶液。用旋涡式混合器使试管 中溶液充分混合，并在室温20±10 下放置15 min。用0号管作对照，按照中华人民共和国药典 （2015年版）四部，通则0401,紫外-可见分光光度法，在595 nm处测定各标准管和样品管的吸光度