昆虫源代谢物抗菌活性筛选

1、昆虫源代谢物抗菌活性筛选摘 要关 键 词：THE DIFFERENT EXTRACTION CONDITIONS ON THE COUGH AND ASTHMA MEDICINE IN CHILDREN INFLUENCE OF THE CONTENT OF Ca2+朗读显示对应的拉丁字符的拼音ABSTRACT This paper through the design of a single fried at different times of gypsum, plaster of different single-solvent volume when fried, fried gyps

2、um used alone in different solvents, and compatibility of prescriptions, medicines and other extraction conditions of different particle size were prepared pediatric cough spiritual preparations, And its Suohan calcium were identified, and then by EDTA complexometric titration Ca2+ content preparati

3、on, formulation and process selection Spirit cough in children to determine the optimal extraction process, to ensure that the content of Ca2 +meet quality standards.Preliminary results show that a single fried gypsum, the boiling time was 60min, with 300mL distilled water as solvent, the obtained s

4、olution the highest concentration of calcium ions. With plaster and other Liuwei decoction, respectively, when the gypsum and licorice decoction when one of the highest concentration of calcium ions. 字典Finally, the conclusions based on the above and taking into account calcium sulfate does not

5、dissolve in the nature of alcohol, so will cast a single fry, fry the remaining ingredients together, gypsum boiled liquid without alcohol precipitation, and the remaining ingredients by alcohol precipitation, then the system of pediatric cough and asthma Spirit, and this process as the best process

6、.KEY WORDS：cough and asthma medicine in chiLdren, extraction，identification of caLcium，determination of Ca2+.目 录第1章前 言1§1.1 小儿咳喘灵总述1§1.2小儿咳喘灵口服液的药效试验、药理作用及用法用量1§1.3 小儿咳喘灵口服液质量标准研究2§1.4 钙离子在人体中的作用3§1.5钙盐的鉴别方法3§1.6 钙含量的测定方法4§1.7 影响钙离子含量的因素5§1.8 小儿咳喘灵的处方及原制备工艺5&#

7、167;1.9选题目的、方向和意义5第2章 实验部分7§2.1 主要实验设备仪器药品一览表7设备一览表（表2-1）7试剂一览表（表2-2）7§2.1.3 仪器一览表（表2-3）8§2.2实验所用试剂的配制8§2.3不同时间单煎石膏9§2.4用不同体积溶剂的单煎石膏9§2.5用不同的溶剂单煎石膏10§2.6两味药材合煎10§2.7三味药材合煎10§2.7所有药材合煎11第3章 结果与讨论13§3.1 制备石膏单煎溶液中钙离子浓度的影响因素13不同煎煮时间对其溶液中钙离子的影响13§3.1

8、.2 不同体积溶剂对其溶液中钙离子的影响14§3.1.3 不同溶剂对其溶液中钙离子的影响15§3.2 两味药材合煎的结果记录18§3.3三味药材合煎的结果记录19§3.4所有药材采用不同配伍合煎19第4章 结论21参考文献22致谢25 第1章 前 言§1.1 研究的目的与意义当今人类与动物的病毒性疾病日渐增多，且日趋严重。由于缺乏有效的抗病毒药物，给人类健康和农业生产带来了巨大的危害和经济损失。因此寻找一种有效的抗病毒物质已成为迫在眉睫的问题。其次，抗菌素的发现，使人类虽然征服了传染病，但由于抗菌求滥用等诸多原因，抗药性日趋严重，水产养殖中抗菌

9、素的过量使用，造成水产品质低下。凡此种种，使科学家致力于研究动物本身存在的大然抗菌抗病毒因子，近年来在昆虫、鱼、哺乳动物等的防御系统中先后发现一些小肽起重要作用，分子在1540肽之间，大小各异。大部分有细胞毒和抗菌活性，有的还具有抗病毒作用。经过分子改造后可以大大降低细胞毒性，提高抗病毒活性，家蝇中分离出的抗菌抗病毒肽，具有一定的抗菌与抗病毒作用。昆虫抗菌肽对大肠杆菌、伤寒杆菌、硝酸盐杆菌等致病菌有抗菌作用，而且部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用，这意味着昆虫抗菌肽在医学中有广阔的应用前景。此外，昆虫抗菌肽对一些癌细胞也有杀伤作用。B4转化细胞，K562细胞，U937细胞，白血病

10、细胞K560以及肺癌细胞A549都能受到抗菌肽的攻击。在不少病原菌对现有的抗生素逐渐产生抗药性，而开发新的抗生素又极为困难的情况下，昆而抗病毒多肤作为一种极具有潜力的广谱抗菌抗病毒物质，尤其是具有抗艾滋病活性，其基因工程菌的构建及生产将具有巨大的经济价值及应用前景。昆虫抗菌肽的发现及其一级结构的阐明，为多肽类抗菌或抗癌药物的研究及其应用开辟了广阔的前景。§1.2昆虫抗菌活性成分研究概况经体内药效学试验研究表明，小儿咳喘灵口服液可明显减少小鼠及豚鼠的咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期及哮喘潜伏期，显著促进小鼠气管酚红排出量，抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀1。经毒性试验表明，小鼠对小儿咳喘灵口服液的最大

11、耐受量为310g/kg。以4 g/kg、2g/kg、1g/kg给大鼠连续两个月灌服，无血象、肝功能等异常反应，处死后各脏器在肉眼及镜下观察未见明显异常改变。小儿咳喘灵口服液主要有镇咳、平喘、抑菌抗炎、提高免疫力等作用。（1）镇咳作用：小儿咳喘灵冲剂对电刺激引咳法所致猫的咳嗽有明显抑制作用，起作用可维持240分钟左右，小儿咳喘灵冲剂和口服液对14%的氨水雾化诱发之咳嗽，可使小鼠咳嗽潜伏期明显延长，2分钟内咳嗽次数明显减少。（2）平喘作用：小儿咳喘灵冲剂和口服液能降低组织胺、乙酰胆碱所致的离体气管条收缩，口服液可使磷酸组织胺雾化所致豚鼠喘息潜伏期明显延长。（3）抑菌抗炎作用：小儿咳喘灵冲剂对角叉菜

12、胶所致大鼠足趾肿胀有明显的抑制作用。其MIC分别为：31.3mg/mL、62.5mg/mL、62.5 mg/mL、125 mg/mL、125 mg/mL。对伤寒杆菌、副伤寒杆菌乙、鼠伤寒杆菌、流感杆菌及白色念珠球菌的MIC为250mg/mL。（4）提高免疫力：咳喘灵能提高小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，其中以后者更加明显；而且能较强地对抗HPA所致的吞噬功能损失。对小鼠脾细胞总数无明显影响。但对PFC数有所增高；咳喘灵对CTX所致PFC减少有明显对抗，但对其所致脾细胞减少则无甚影响。咳喘灵对正常小鼠淋转无明显影响，但可部分恢复CTX抑制的小鼠淋转功能。（5）其他作用：小儿咳喘灵口服液对三联菌苗所

13、致家兔发热有良好的退热作用，对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、肺炎链球菌及绿脓杆菌有一定抑制作用，能明显提高其免疫力。口服用量：2岁以内一次5毫升；3-4岁一次7.5毫升；5-7岁一次10毫升，一日3-4次。§1.3 小儿咳喘灵口服液质量标准研究为确保口服液的质量，保证用药安全有效。可采用薄层鉴别法对小儿咳喘灵口服液中的麻黄、板蓝根、苦杏仁、金银花进行定性鉴别2； 采用HPLC法测定金银花中的绿原酸含量。结果：通过薄层鉴别法，分别鉴别出麻黄中的盐酸麻黄碱，板蓝根中的精氨酸，苦杏仁中的苦杏仁苷，金银花中的绿原酸；通过HPLC法测得金银花中绿原酸的含量稳定，可靠；平均回收率为

14、98.80%，RSD为1.45%。结论：该方法能够对小儿咳喘灵口服液进行准确、快速地定性、定量分析，稳定、可靠，重现性好，可用于该制剂的质量控制。其次对于用贝母花、甘草、桔梗、远志、半夏5味中药制备的其质量标准用们用薄层层析法对甘草桔梗进行定性鉴别3，并用甘草次酸及桔梗皂苷作为对照品，以甘草次酸为定量测定指标成分，应用高效液相色谱法进行含量测定，以控制该口服液的质量。本次实验以麻黄、板蓝根、苦杏仁、金银花、石膏、瓜蒌、甘草七味中药为处方制备小儿咳喘灵口服液。§1.4 钙离子在人体中的作用钙是一种生命必需元素，也是人体中含量最丰富的宏量金属元素，含量仅次于C、H、O、N。正常成人体内总

15、钙可达L0001200g，约占人体体重的2左右。其中99以上的钙存在于骨骼、牙齿中，余下的不足1的钙分布在体液及其它组织中。在体内钙离子主要以游离和结合两种形式存在，两者之间处于动态平衡。在生命活动中起主要作用的是细胞内外游离钙离子浓度。钙离子对神经传导、肌肉收缩、激素的分泌、促进血液的凝固、维持心脏的正常收缩、保持细胞的完整性和细胞分裂、DNA的合成等方面起重要的调控作用，钙离子的改变直接影响生物体，导致机体产生多种疾病。根据研究4，109种疾病直接与钙的迁移聚集相联系，主要有骨骼系统疾病(如佝偻病，骨质疏松，骨质增生，骨生长痛，软骨病，骨变形，各种骨损伤等)，牙齿疾病，免疫系统疾病，神经系

16、统疾病，肌肉组织疾病，血液系统疾病，酶变异疾病，细胞粘着性疾病，纤毛运动性疾病，呼吸系统疾病，肠胃系统疾病，肝胆疾病，眼睛疾病，肾脏系统疾病，生殖系统疾病，膀胱，肛肠疾病，各种皮肤疾病等。钙离子(Ca2+)是普遍存在的细胞内信使，调控多种细胞作用，如基因转录、平滑肌收缩和细胞增殖等。钙离子对呼吸道纤毛运动调控中的作用5以作了大量研究，并得出钙离子对呼吸道上纤毛运动有直接和间接的调控作用6,7。其次，氯离子通道在肌强直(myotonia)、肺囊性纤维化(CF)的发病中起着重要作用,钙离子可以激活氯离子通道，激活氯离子通道与呼吸疾病的气道黏液高分泌有关8，并对哮喘患者的黏液高分泌和杯状细胞的化生有

17、重要的作用9。§1.5钙盐的鉴别方法根据药典10方法取待测液2mL，加入稀盐酸（9.5%10.5%）5mL作为供试品溶液，取供试品溶液（120），加入甲基红指示剂两滴，用氨试液中和，再加滴稀盐酸至恰酸性，用草酸铵试液，即生成白色沉淀，分离此沉淀，沉淀不溶于醋酸，可但溶于盐酸。本实验按照药典方法对小儿咳喘灵中的钙离子进行鉴别。§1.6 钙含量的测定方法目前关于溶液中钙离子含量的测定方法有许多种。其各种方法都有优缺点，对于不同类型的物质中钙含量的测定方法各有不同。通常，钙离子含量的测定分析方法有原子吸收光谱法11,12,13、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)14,1

18、5,16,17,18、X射线荧光光谱法19等离子体原子发射光谱法等，但使用这些方法共有是周期较长、设备昂贵、操作复杂、难以普及等的特点。其次，在pH=11.0的氨水氯化铵介质中,苦胺酸偶氮变色酸与钙离子生成稳定的络合物,据此建立了苦胺酸偶氮变色算褪色光度法测定药物中钙的方法20。钙制品常采用高锰酸钾滴定法测其钙含量21，即含有EDTA的pH值为3.54.5的氨性溶液中，先用草酸盐选择性地沉淀钙离子，沉淀物经过滤、洗涤后，用稀硫酸将所得草酸钙沉淀物溶解，然后再7585条件下用高锰酸钾标准溶液滴定，测定结果的相对标准偏差（RSD）为0.03%（n=5）,回收率（R）在96.30%101.12%，此

19、方法简单、快捷，准备、干扰少。食品中常用火焰原子吸收光度法或TDEA滴定法测定22,23,火焰原子吸收光谱法适宜测定钙含量较低（以mg/kg计）的钙食品。该方法虽干扰小，速度快，效果好，但因仪器昂贵、操作技术难掌握，普通实验室难以普及应用。对于含量高的（以g/100g计）食品，国家标准方法为EDTA容量滴定法，该方法虽操作简单，但存在着干扰现象严重、终点变化不明显、指示剂水溶液不稳定（固体指示剂用量不宜掌握）且易封闭等问题，使得测定结果的准确性较差。其次亦有采用402型钙离子选择性电极进行钙离子含量的测定24，此电极对钙离子浓度10-210-4moL/L范围内有理想的能斯特响应，斜率为-29.

20、25mv/p Ca（20），重现性与选择性较好，试剂用量少，不受样品浑浊及颜色的影响。应用此电极测定食品钙含量，精密度和准确度较理想。此外，对钙含量的测定，其方法还有化学分析法25、半微量法26、电位滴定法27、离子色谱法28、紫外分光光度法29、当量溶液分光光度法30、显色法31等。本次实验研究的不同提取条件对小儿咳喘灵中钙离子含量的影响，主要是通过大致测定钙离子的量进行比较。故采用药典中以钙紫红素为指示剂，用TDEA络合滴定法进行测定。§1.7 影响钙离子含量的因素石膏是小儿咳喘灵中含钙离子的主药，石膏是含结晶水的硫酸钙（CaSO4·2H2O）,属于矿物药物，纯净的Ca

21、SO4是微溶物质，其溶解度在040之间随温度的升高而增加，但温度超过40其溶解度随温度的升高而降低32。但有学者认为石膏属于矿物药物，应先煎久煎，才能使有效成分溶出，并且临床运用石膏主张先煎33,34。此外与不同的药物配伍煎煮所得滤液中的含量也有所不同。因此，对石膏单煎、煎煮时间不同、与不同药物配伍煎煮都会影响最后钙离子的溶出量。§1.8 小儿咳喘灵的处方及原制备工艺【处方】 麻黄：25g 苦杏仁：125g 金银花：250g 板蓝根：250g 石膏：375g 甘草：125g 瓜蒌：125g 。 【制备工艺】：用以上七味药中的苦杏仁、石膏、板蓝根、甘草、瓜蒌加水煎煮一小时，滤过；药渣与

22、麻黄、金银花加水煎煮一小时，滤过，合并滤液，静置，取上清液，浓缩至流浸膏。加入无水乙醇，使含醇量达65%，搅拌均匀搜静置冷藏；取上清液，滤过，回收乙醇，浓缩至适量，加入甜菊糖及防腐剂适量，搅拌均匀，滤过，加水至2000mL，即得。§1.9选题目的、方向和意义由于钙离子(Ca2+)是普遍存在的细胞内信使，调控多种细胞作用，如基因转录、平滑肌收缩和细胞增殖等。且经研究证明钙离子对呼吸道纤毛运动有调控作用，其次，氯离子通道在肌强直(myotonia)、肺囊性纤维化(CF)的发病中起着重要作用,钙离子可以激活氯离子通道，激活氯离子通道与呼吸疾病的气道黏液高分泌有关，并对哮喘患者的黏液高分泌和

23、杯状细胞的化生有重要的作用。小儿咳喘灵中钙离子含量的增高有助于提高药物的疗效，满足目前国家药监局对咳喘灵中钙离子含量的要求。而目前各药厂所制备的小儿咳喘灵中的钙离子含量一般较低，不能满足国家药监局的要求。为解决以上问题，对咳喘灵的制备条件进行改进和优化，拟采用不同的时间、溶剂和煎煮时的配伍不同进行试验，而后进行钙离子的鉴别和检测，分析各提取条件不同对钙离子含量的影响，筛选出最佳的制备工艺，为小儿咳喘灵的制备提供理论基础。这对改进和优化咳喘灵的制备工艺，提高其中钙离子含量的条件探索有重要的意义。第2章 实验部分§2.1 主要实验设备仪器药品一览表§设备一览表（表2-1）表2-

24、1主要实验设备设备规号厂家调温加热套北京中兴伟业仪器有限公司旋转蒸发器RE52CS型上海亚荣生化仪器厂恒温水浴锅B-220型上海亚荣生化仪器厂电子天平JA3003型上海天平仪器厂分析天平BT25S型上海秦迈仪器有限公司§试剂一览表（表2-2）表2-2主要药品原料名称级别厂家甲基红化学纯上海崇明县裕安人民公社十六大队综合厂浓盐酸分析纯开封市芳晶化学试剂有限公司无水乙醇分析纯天津市化学试剂三厂草酸铵分析纯天津石英钟厂霸州市化工分厂氯化钠分析纯开封市芳晶化学试剂有限公司冰醋酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公乙二胺四乙酸二钠分析纯天津市化学试剂三厂氨

25、水分析纯开封市芳晶化学试剂有限公司§ 仪器一览表（表2-3）表2-3主要仪器仪器名称型号规格数量烧杯500mL，250mL，100mL，50mL各4个漏斗中3个量筒100mL，50mL，20mL，10mL各一个容量瓶1000mL，500mL,250mL，100mL1个，2个,5个，3个圆底烧瓶500mL1个锥形瓶250mL3个试管20个试管架1个胶头滴管3个玻璃棒长，中各1根洗耳球1个移液管1mL，5mL，10mL各1支抽滤瓶500mL1个布氏漏斗中1个酸式滴定管50mL1支药匙大，中，小各1个§2.2实验所用试剂的配制1. 甲基红指示剂：取甲基红0.1g，加0.05mol

26、/LNaOH溶液7.4mL使其溶解，再加蒸馏水稀释至200mL，即得。2. 氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4.3g，加蒸馏水使溶解成100mL，即得。3. 草酸铵溶液：取草酸铵3.5g，加水使溶解成100mL，即得。4. 稀醋酸溶液：取冰醋酸6mL，稀释至100mL，即得。5. 稀盐酸溶液：取盐酸234mL稀释至1000mL，即得。所得稀盐酸应为9.5%10.5%。6. 氨试液：取浓氨溶液400mL，加水稀释至1000mL，即得。7. EDTA滴定液：取19gEDTA，加水溶解，稀释至1000mL，即得。§2.3钙离子的测定溶液中钙盐的鉴别：按照药典方法，取上述所得滤液bmL，加入稀盐酸5

27、mL作为供试品溶液，取供试品溶液（120），加入甲基红指示剂两滴，用氨试液中和，再滴加稀盐酸至恰酸性，用草酸铵试液，观察其是否有白色沉淀生成。取白色沉淀，加入稀醋酸，观察白色沉淀是否溶液，若不溶解，则加入稀盐酸，观察弃是否溶解；若无白色沉淀重新则取供试品1mL，分别减少稀释的倍数而后进行重新鉴别。溶液中钙离子含量的滴定：取上述所得滤液5mL，置于250mL的锥形瓶中，加蒸馏水50mL，用NaOH调pH至13左右，加入钙紫红素指示剂0.1g。用0.05moL/LEDTA滴定液滴定至溶液由紫色变成纯蓝色，每1mL的EDTA滴定液相当于22.42mg的C12H22CaO4·H2O。

28、7;2.4石膏单煎溶液中钙离子浓度的影响因素§2.4.1不同煎煮时间钙离子溶出度的影响精确称取原处方1/20剂量的石膏（18.75g），四份。分别置于300mL的烧杯中，加蒸馏水100mL，用恒温电热套加热至沸腾，并使其分别保持沸腾30min、60min、90min、120min。而后待溶液冷却至室温后进行抽滤，弃滤渣，取滤液，并分别准确量取滤液的体积。同§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别。同§2.3中的溶液中钙离子含量的滴定方法，对此溶液钙离子的含量进行测定。§2.4.2 不同体积溶剂对钙离子溶出度的影响精确称原处方1/20剂量的石膏（1

29、8.75g），五份。置于500mL的烧杯中，分别加蒸馏水100mL、150mL、200mL、250mL、300mL。用恒温电热套加热至沸腾，并使均其保持沸腾60min。而后待溶液冷却至室温后进行抽滤，弃滤渣，取滤液，并分别准确量取滤液的体积。同§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别。同§2.3中的溶液中钙离子含量的滴定方法，对此溶液钙离子的含量进行测定。§ 不同溶剂对其溶液中钙离子的影响 实验步骤：精确称原处方1/20剂量的石膏（18.75g），六份。置于500mL的烧杯中，分别加0.5%HCL、1.0% HCL、 1.5% HCL、 0.5%NaCL、

30、0.9% NaCL 1.1% NaCL各300mL。用恒温电热套加热至沸腾，并使均其保持沸腾60min。而后待溶液冷却至室温后进行抽滤，弃滤渣，取滤液，并分别准确量取滤液的体积。同§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别。同§2.3中的溶液中钙离子含量的滴定方法，对此溶液钙离子的含量进行测定。§2.6两味药材合煎对钙离子溶出度的影响精确称取原处方1/20剂量的石膏（18.75g），六份。分别和麻黄（1.25g）、金银花（12.5g）、苦杏仁（6.25g）、板蓝根（12.5g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g）置于500mL的烧杯中， 加蒸馏水300m

31、L，合煎。用恒温电热套加热至沸腾，并使均其保持沸腾60min。而后待溶液冷却至室温后进行抽滤，弃滤渣，取滤液，并分别准确量取滤液的体积。同§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别。溶液中钙离子含量的滴定：取上述所得滤液amL，置于250mL的锥形瓶中，加蒸馏水50mL，用NaOH调pH至13左右，加入钙紫红素指示剂0.1g。用0.05moL/LEDTA滴定液滴定至溶液由桔红色变成翠绿色，每1mL的EDTA滴定液相当于22.42mg的C12H22CaO4·H2O。§2.7三味药材合煎对钙离子的溶出度的影响由§2.6的实验中得出石膏与甘草、瓜蒌合煎时

32、溶液中钙离子的溶出度较高，股采用此三味药材合煎。精确称原处方1/20剂量的石膏（18.75g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g）置于500mL的烧杯中， 加蒸馏水300mL，合煎。用恒温电热套加热至沸腾，并使均其保持沸腾60min。而后待溶液冷却至室温后进行抽滤，弃滤渣，取滤液，并分别准确量取滤液的体积。同§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别。同§2.6中的溶液中钙离子含量的滴定方法，对此溶液钙离子的含量进行测定。§2.7所有药材合煎对钙离子的溶出度的影响实验步骤：精确称取原处方1/20剂量的石膏（18.75g）、麻黄（1.25g）、金银花（12

33、.5g）、苦杏仁（6.25g）、板蓝根（12.5g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g）各两份。分别按以下方案煎煮制备小儿咳喘灵口服液，并对制备的小儿咳喘灵口服液成品按照§2.3中的溶液中钙盐的鉴别方法，对钙盐进行鉴别，按照§2.6中的溶液中钙离子含量的滴定方法，对此溶液钙离子的含量进行测定。方案一/A：取原处方1/20剂量的石膏（18.75g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g）置于500mL烧杯中，加蒸馏水300mL合煎一小时，待溶液冷却至室温后过滤，取滤液a。将滤渣与原处方1/20剂量的麻黄（1.25g）、金银花（12.5g）、苦杏仁（6.25g）、板蓝根（1

34、2.5g）置于500烧杯中，加蒸馏水300mL合煎一小时，待溶液冷却至室温后过滤，取滤液b。将滤液a和滤液b合并，静置，取上清液，旋蒸浓缩至流浸膏，加入无水乙醇，使含醇量达65%，搅拌均匀，静置，冷藏。取上清液过滤，回收乙醇，浓缩至适量，加水至100mL，即得。方案二/B：将药材粉碎进行实验，其余步骤同方案一。方案三/C：取原处方1/20剂量的石膏（18.75g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g）、苦杏仁（6.25g）、板蓝根（12.5g）置于500mL烧杯中，加蒸馏水300mL合煎一小时，待溶液冷却至室温后过滤，取滤液a。将滤渣与原处方1/20剂量的麻黄（1.25g）、金银花（12.5

35、g）置于500烧杯中，加蒸馏水300mL合煎一小时，待溶液冷却至室温后过滤，取滤液b。将滤液a和滤液b合并，静置，取上清液，旋蒸浓缩至流浸膏，加入无水乙醇，使含醇量达65%，搅拌均匀，静置，冷藏。取上清液过滤，回收乙醇，浓缩至适量，加水至100mL，即得。方案四/D：将药材粉碎进行实验，其余步骤同方案三。方案五/E：取原处方1/20剂量的石膏（18.75g）置于500mL烧杯中，加蒸馏水300mL，待溶液冷却至室温后过滤，取滤液a，旋蒸浓缩至其总体积小于100mL。其余药材麻黄（1.25g）、金银花（12.5g）、苦杏仁（6.25g）、板蓝根（12.5g）、甘草（6.25g）、瓜蒌（6.25g

36、）置于500烧杯中，加蒸馏水300mL合煎一小时，待溶液冷却至室温后过滤，得滤液b，将滤液b旋蒸浓缩至流浸膏，加入无水乙醇，使含醇量达65%，搅拌均匀，静置，冷藏。取上清液过滤，回收乙醇，浓缩至适量，而后加入浓缩后的滤液a，加水定容至100mL。方案六/F：将药材粉碎进行实验，其余步骤同方案五。第3章 结果与讨论§3.1石膏单煎溶液中钙离子浓度的影响因素§不同煎煮时间对其溶液中钙离子的影响设定石膏的单煎时间分别为30min、60 min、90 min、120 min，通过实验得出其最后所得滤液的体积V（mL），溶液的物质的量浓度c（mol/L），以及溶液的质量浓度m（mg/

37、g）如表3-1。物质的量浓度与煎煮时间之间的比例关系如图3-1，质量浓度与煎煮时间之间的比例关系曲线如图3-2。表3-1 石膏单煎不同时间所得滤液的参数t（min）306090120V（mL）68492620c（mol/L）0.01650.01650.01720.0185m（mg/g）2.39361.72480.98730.8107 对所得溶液进行钙盐的鉴别试验。当供试品按药典方法稀释20倍后，鉴别均为负反应，稀释10倍以及5倍时依然均为负反应。而供试品稀释3倍时鉴别均为正反应，即有白色沉淀生成，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由图3-2可知，当煎煮时间为30min时，所得滤液中钙离

38、子的含量最高，为使得所制备的溶液中的钙离子含量最高，应该选择石膏的煎煮时间为30min中最佳，但是处方中由于石膏亦要与其他药材合煎，故其煎煮时间必定大于30min，且由图3-1可知煎煮60min时溶液的物质的量浓度与煎煮30min的并无太大差异，而后在进一步增加煎煮时间虽然使溶液的物质的量浓度有所增加，但其所得滤液的体积太少。故选择石膏的最佳的单煎时间为60min。图3-1石膏单煎不同时间所得滤液的物质的量浓度曲线图3-2石膏单煎不同时间所得滤液的质量浓度曲线§ 不同体积溶剂对其溶液中钙离子的影响设定石膏单煎的时间为60min，以蒸馏水为溶剂，所用体积分别为100mL、150 mL、

39、200 mL、250 mL、300 mL。通过实验得出其最后所得滤液的体积V（mL），溶液的物质的量浓度c（mol/L），以及溶液的质量浓度m（mg/g）如表3-2，质量浓度与溶剂体积之间的关系曲线如图3-3。表3-2 用不同体积溶剂单煎石膏所得滤液的参数v（mL）100150200250300V（mL）4999140190213c（mol/L）0.0160.01530.01470.01530.0155m（mg/g）1.67253.23144.39046.20167.0432应用药典方法对所得溶液进行钙盐的鉴别试验。当供试品按药典方法稀释20倍后，鉴别均为负反应，稀释10倍以及5倍时依然均为负

40、反应。而供试品稀释2倍时鉴别均为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由图3-3可知，当煎煮时间为60min，所用溶剂体积为300mL时，所得滤液中钙离子的含量最高，故选择石膏的单煎时间为60min，溶剂蒸馏水体积用量为300mL时为最佳单煎提取条件。图3-3不同体积溶剂单煎石膏所得滤液的质量浓度曲线§ 不同溶剂对其溶液中钙离子的影响以0.50%HCL、1.00% HCL、1.50% HCL、0.50%NaCL、0.90% NaCL、1.50% NaCL为溶剂，各取300mL，对石膏进行单煎60min。通过实验得出其最后所得滤液的体积V（mL），溶液的物质

41、的量浓度c（mol/L），以及溶液的质量浓度m（mg/g）如表3-3和表3-4，质量浓度与溶剂浓度之间的关系曲线如图3-4。表3-3 用不同浓度的稀盐酸做溶剂单煎石膏所得滤液的参数HCL（%）0.5%1.0%HCL1.5%HCLV（mL）205190235c（mol/L）0.07100.10270.1027m（mg/g）31.050741.627762.5163表3-4用不同浓度的氯化钠做溶剂单煎石膏所得滤液的参数NaCL(%)0.50%0.90% 1.50% V（mL）213216223c（mol/L）0.02250.02630.0358m（mg/g）10.224012.119017.031

42、3应用药典方法对所得表3-3中得溶液进行钙盐的鉴别试验。当供试品按药典方法稀释20倍后，鉴别均为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由于石膏的主要成分是含水硫酸钙（CaSO4·2H2O），而硫酸钙在铵盐溶液、硫代硫酸钠溶液、氯化钠溶液或酸类中溶解，在水或乙醇中不溶。又由于用铵盐溶液、硫代硫酸钠溶液做溶剂时，对人体的健康不利。故本实验选择以稀盐酸和氯化钠为溶剂，由图3-4可知，所得溶液中的钙离子的质量浓度随稀盐酸浓度的增加而增加，理论上为了使所得溶液中的钙离子含量较高，应当增加稀盐酸的浓度。但考虑到人饮用时的耐受性，不能选用太高浓度的盐酸，故选用1.5%的

43、盐酸。图3-4不同浓度的稀盐酸单煎石膏所得滤液的质量浓度曲线应用药典方法对所得溶液进行钙盐的鉴别试验。当供试品按药典方法稀释20倍后，鉴别均为负反应，稀释10倍均为负反应。而供试品稀释5倍鉴别均为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由图3-5可知，所得溶液中的钙离子的质量浓度随氯化钠浓度的增加而增加，理论上为了使所得溶液中的钙离子含量较高，应当增加氯化钠的浓度。但考虑到人体所用生理盐水的浓度为0.9%，从经济和人体的接受能力以及服用时的耐受性，选取0.9%为最佳浓度。图3-5不同浓度的氯化钠单煎石膏所得滤液的质量浓度曲线§3.2 两味药材合煎对钙离子浓度

44、的影响 使石膏分别与其余六味药材分别合煎，以300mL蒸馏水为溶剂，煎煮60min。通过实验得出其最后所得滤液的体积V（mL），溶液的物质的量浓度c（mol/L），以及溶液的质量浓度m（mg/g）如表3-5，其质量浓度之间比例如图3-6。表3-5两味药材合煎所得滤液的参数合煎配伍石膏和麻黄石膏和苦杏仁石膏和板蓝根石膏和甘草石膏和瓜蒌石膏和金银花V（mL）193204190215205185c（mol/L）0.01700.01730.02060.02280.02030.0193m（mg/g）6.99957.52908.349910.45768.87797.6171应用药典方法对所得溶液进行钙盐的

45、鉴别试验。当供试品按药典方法稀释20倍后，鉴别均为负反应，稀释10倍依然均为负反应。而供试品稀释5倍时，石膏和板蓝根、石膏和甘草、石膏和瓜蒌的鉴别均为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸，其余得为负反应，将其余配伍的合煎液的供试品稀释3倍时鉴别均为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由图3-6可知，石膏和甘草合煎时所得的溶液中的钙离子的浓度最高，其次为石膏和瓜蒌、石膏和板蓝根。最后的为石膏和苦杏仁、石膏和金银花、石膏和麻黄。故采用选择石膏、甘草、瓜蒌三味药材最佳合煎配伍。图3-6两味药材合煎所得滤液的质量浓度曲线A：石膏和麻黄B：石膏和

46、苦杏仁C：石膏和板蓝根D：石膏和甘草E：石膏和瓜蒌F：石膏和金银花§3.3三味药材合煎对钙离子浓度的影响 将石膏、甘草、瓜蒌三味药材合煎，而后浓缩至适量后，用蒸馏水定容至100ml。而后按照药典方法对溶液中的钙盐进行鉴别，当供试品稀释10倍时，其反应为正反应。经EDTA滴定后计算的所得溶液中的钙离子的物质的量浓度为0.04mol/L,质量浓度为8.5300mg/g。§3.4所有药材采用不同配伍合煎对钙离子浓度的影响 按照方案一到方案六进行实验。通过实验得出其最后所得滤液的体积V（mL），溶液的物质的量浓度c（mol/L），以及溶液的质量浓度m（mg/g）如表3-6，其质量浓

47、度之间比例如图3-7。表3-5所有药材采用不同配伍合煎所得滤液的参数合煎配伍方案一方案二方案三方案四方案五方案六V（mL）100100100100100100c（mol/L）0.00920.01500.01250.00830.04830.0433m（mg/g）1.95563.20002.66671.777810.31119.2444应用药典方法对所得溶液进行钙盐的鉴别试验，鉴别反应为正反应，即有白色沉淀生，且此白色沉淀不溶于稀醋酸，但可溶于稀盐酸。由图3-7可知，按照方案五所制备的小儿咳喘灵口中钙离子含量最高。与方案一至四相比，其钙离子含量有很大的提高，这是由于石膏的主要成分是含水硫酸钙（Ca

48、SO4·2H2O），而硫酸钙几乎不溶于乙醇，故当采用方案一至四，其所得的总浓缩液经醇沉，在将溶液中的杂质沉淀后除去的同时也将溶液中的大部分钙盐沉除了。而方案五和方案六行比，理论上药材经粉碎后应当更有利于有效成分的渗出，但同时也增加了煎煮液的浑浊度，故在进行醇沉时有较多的沉淀，这有可能使得药液中的部分钙盐亦被沉除。由此可得出，采用方案五是备小儿咳喘灵时，可以较大的提高所得药液中的钙离子的含量，同时满足国家药典对钙盐的鉴别要求。图3-7所有药材合煎所得滤液的质量浓度曲线A: 方案一B: 方案二C: 方案三D方案四:E方案五:F: 方案六第4章 结论由于钙离子主要是从石膏中溶出的，所以本实

49、验首先对影响石膏中钙离子溶出的因素进行探测。其中影响钙离子溶出的可能因素有煎煮的时间、溶剂的用量、所用溶剂的种类以及和其他药材合煎时配伍的不同。通过实验得出煎煮时间为60min，所得的溶液中的钙离子的质量浓度最高；以不同体积的蒸馏水为溶剂时，溶液中钙离子的质量浓度随溶剂亮的增加而升高，选择300mL为其最终煎煮是溶剂的用量。石膏分别和其它六味药材合煎，实验结果证明石膏和甘草合煎时所得的溶液中的钙离子的浓度最高，其次为是石膏和瓜蒌的合煎，最后的为石膏和板蓝根、石膏和苦杏仁、石膏和金银花、石膏和麻黄。根据以上实验结果，采用石膏、甘草和瓜蒌进行合煎实验，实验证明此三位合煎时，其所得溶液中的钙离子浓度

50、并不会下降。故采用选择石膏、甘草、瓜蒌三味药材最佳合煎配伍。根据以上所得的结论，分别设计方案一至方案六。并经实验得出当采用方案五时，所制备的小儿咳喘灵口服液中的钙离子质量浓度最高，即：石膏单煎，滤液不经醇沉；其余六味药材合煎，滤液经醇沉，冷藏放置后回收醇，浓缩至适量，将石膏单煎滤液和其余六味药材的浓缩液合并，加入防腐剂等加水定容。经实验证明此方案为小儿咳喘灵制备的最佳方法。参考文献1 马瑛，王嗣岑，董亚琳，小儿止咳口服液质量标准研究J，西安交通大学药学院中国药房（医院制剂），2004,15:10.2 王西芳，郑伶俐，顾国强等，小儿咳喘灵口服液质量标准研究J.陕西中医学院学报， 2007,30(

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