不同乳腺癌细胞株雌激素和孕激素受体的Westernblot检测_图文

1、不同乳腺癌细胞株雌激素和孕激素受体的Western blot 检测3陶德定1高纯1江敏2吴剑宏1冯永东1龚建平1华中科技大学同济医学院附属同济医院1分子医学中心,2急诊科,武汉430030摘要目的建立人类雌激素受体(estrogen receptor ,ER 和孕激素受体(progesterone receptor ,PR Westernblot 检测方法,并对不同乳腺癌细胞株ER 、PR 表达情况进行测定。方法取不同乳腺癌细胞株对数生长期细胞提取总蛋白,分别用ER单克隆抗体1D5和PR 单克隆抗体PgR636以Western blot 方法对ER 、PR 的表达情况进行检测,并与同期固定细胞

2、的流式细胞术(FCM 检测结果进行比较。结果T 247d 、MCF 27、ZR 27521细胞ER的Western blot 检测可得到清晰且分子量正确的条带,T 247d 、ZR 27521细胞可见清晰且分子量正确的PR 条带,同期固定细胞ER 、PR 阳性表达的FCM 检测结果与Western blot 检测结果一致。结论Western blot 检测ER 、PR 的方法是可行的。关键词雌激素受体;孕激素受体;Western blot 法中图法分类号R34918Western blot Analysis of Estrogen and Progesterone R eceptorsin D

3、ifferent Breast C ancer Cell LinesTao Deding 1,G ao Chun 1,Jiang Min 2et al1Molecular Medici ne Center ,2Depart ment of Emergency ,Tongji Hospital ,Tongji MedicalCollege ,Huaz hong U niversity of Science and Technology ,W uhan 430030Abstract Objective To establish Western blot analysis of human estr

4、ogen receptor (ER and proges 2terone receptor (PR ,and detect the expression of ER and PR in different human breast cancer cell lines.Meth 2ods After extracting total proteins from different exponentially growing cell lines ,the expression of ER and PRwas detected by Western blot with 1D5and PgR636,

5、monoclonal antibody to ERand PR ,respectively.And the results were compared with those of fixed cells detected by flow cytometry.R esults Clear and correct ERbands were observed by Western blot analysis in the lysates from cell lines T 247d ,MCF 27and ZR 27521.In addi 2tion ,clear and correct PR ban

6、ds were observed in the cell lines T 247d and ZR 27521.Positive expression of ER and PR in different fixed cells detected by flow cytometry was the same with that analyzed by Western blot.Conclusion Western blot analysis of ER and PR are feasible.K ey w ords estrogen receptor ;progesterone receptor

7、;Western blot3卫生部临床学科重点资助项目(No 197070239,No 120012537陶德定,男,1965年生,副研究员研究证实,乳腺癌细胞雌激素受体(estrogen receptor ,ER 和孕激素受体(progesterone recep 2tor ,PR 表达水平对评价乳腺癌患者的预后及辅助治疗的效果具有重要意义13。不同乳腺癌细胞ER 、PR 表达具有一定的差异,作为蛋白质研究的经典方法,Western blot 可对ER 、PR 表达形式、分子量大小进行分析。本研究以乳腺癌细胞株为模式细胞,用Western blot 对不同乳腺癌细胞株ER 、PR 进行检测。

8、1材料与方法111主要试剂及仪器纯化人类ER单克隆抗体1D5、PR 单克隆抗体PgR636、同型对照鼠Ig G 1、异硫氰酸荧光素(FITC 标记的二抗均购自DA KO 公司。分子量47kD (1kD =019921ku 的ER 标准ER(22第33卷第5期第602页2004年10月华中科技大学学报(医学版J Huazhong Univ Sci Tech Health Sci Vol.33No.5P.602Oct.2004185、肌动蛋白(Actin单克隆抗体Actin(C22购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig、ECL膜、聚丙烯酰胺凝胶均购自Amersham Life

9、 Science公司。化学发光显色试剂盒(Super Signal West Pico Trial K it、蛋白质定量试剂盒(BCA Protein Assay K it、ECL膜洗脱缓冲液均购自PIERCE公司。细胞培养基及其添加剂购自G ibco公司。支原体检测试剂盒购自Roche公司。全分子量蛋白质标准(Full2range rainbow markers购自Amersham Biosciences公司。47kD的ER标准用上样缓冲液和1%SDS按2g/ml稀释、分装,-20冻存备用。FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。112细胞培养人类乳腺癌细胞株MM231、MM4

10、53、MM436、MM134V I、HBL2100、B T2549、ZR2752 1、MCF27、T247d(均购自A TCC公司用含10%热灭活胎牛血清及青、链霉素(终浓度分别为105U/L,100mg/L的RPM I1640培养。MCF27培养基中需添加终浓度为1mmol/L的丙酮酸钠, 011mmol/L的非必需氨基酸,10mg/L的胰岛素。T247d、MM436、B T2549培养基中补加10mg/L 的胰岛素。细胞株B T220(A TCC公司用M EM 培养基培养,并添加10%热灭活胎牛血清,011 mmol/L的非必需氨基酸及青、链霉素。所有细胞培养物用支原体检测试剂筛查阴性。1

11、13细胞裂解和ER、PR的Western blot取对数生长期细胞(长至覆盖约75%瓶用0105%胰蛋白酶、0102%ED TA消化30s2 min,加入完全培养基终止消化,4800r/min 离心弃上清,PBS洗涤1遍,加入200l的1% SDS裂解细胞,裂解产物先后用7号、5号针头反复抽打(冰浴上进行,按PIERCE蛋白测定试剂盒说明对蛋白质进行定量,然后分装-80保存备用。临用前,冰上冻融样本,取一定体积(含50g蛋白质的样本至一干净的E ppendorf管,加入4l的5SDS上样缓冲液(0131mol/L Tris,25%2巯基乙醇,50%甘油,1215%SDS, 01005%溴酚蓝,

12、p H618,补加1%的SDS至20l,95变性5min,将样本置于冰上并尽快上样。按常规方法4灌制10%的SDS2聚丙烯酰胺凝胶,实验样本每道点样20l,47kD的ER标准点样10l,全分子量的蛋白质标准点样10l, 100V电压电泳115h,将凝胶上的蛋白质转印至ECL膜上(100V,1h,用含5%脱脂奶粉的PB2ST(含015%Tween220的PBS溶液室温封闭2 h,然后分别与用含2%脱脂奶粉的PBST稀释的ER抗体1D5(1100,1200,1500或PR抗体PgR636(1100,1200,15004孵育过夜(100r/min。PBST溶液洗涤3次,再与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠

13、Ig(17500室温反应115 h,化学发光试剂盒显色,曝光,对ER或PR表达情况进行检测。将用过的ECL膜用洗脱液室温洗脱15min,再用Actin抗体(110000染色并检测。114细胞固定和ER、PR的FCM检测收获对数生长期细胞,按文献5方法用0125%多聚甲醛和75%冷乙醇固定,分离胞核,用反应缓冲液(含1%BSA和0105%Triton X2100的PBS溶液洗涤2遍并调节细胞浓度约1106/ ml,各取100l悬液加入不同试管,分别加入2l 的抗体1D5、PgR636、同型对照鼠Ig G1,4反应过夜,用150稀释的荧光二抗室温避光反应30 min后洗涤,加入015ml PBS,

14、用FACS Calibur流式细胞仪对样本免疫荧光进行检测。2结果211Western blot检测结果不同乳腺癌细胞株的蛋白质提取物在经电转印后,分别用1100、1200、1500稀释的ER抗体1D5进行标记。在1200和1500稀释的1D5标记显色后的X光片上没有明显可见的蛋白印迹条带,而以1100稀释的1D5标记显色后,可见明显的分子量正确的条带,见图1。在用稀释度分别为1100、1200、1500的PR抗体PgR636标记时,结果显示1100稀释的PgR636染色后,非特异条带较多,而PgR636在1500稀释时条带太弱,只有当PgR636在1200稀释时可见明显且分子量正确的条带,见

15、图2。经洗脱后的ECL膜再用肌动蛋白抗体Actin (C22标记后,在X光片上可见明显且分子量正确的条带,且不同乳腺癌细胞株所对应的条带浓淡一致,说明不同样本的点样量一致,见图3。212FCM检测结果不同乳腺癌细胞在分别用1D5和PgR636标记后,在同型对照样本的荧光直方图上设置逻辑门,以阳性细胞数不大于5%为标准,对受体标记阳性细胞进行定量检测。结果显示,T247d、MCF27、ZR27521细胞株1D5阳性标记率95%,其他细胞株阳性标记率95%,而其他细胞阳性标记率5% 。3讨论乳腺癌是严重危害人类健康的恶性疾病,雌激素和孕激素水平与乳腺癌的发生、发展密切相关2。雌激素和孕激素通过与相

16、应的ER 和PR 结合后发挥作用,在不同的靶器官,其作用也不尽相同,这取决于受体在不同组织中的分布6。乳腺癌细胞ER 、PR 表达水平和分布可提示预后,并指导内分泌治疗13。1986年Greene 从人类乳腺癌细胞中纯化出ER 并克隆出其cDNA 7,1996年Mosselman 等发现了一种新的雌激素受体,将其命名为ER,并将传统的雌激素受体命名为ER 8,随研究的深入,Pfeffer 和Moore 等报道ER存在5种不同的变异体(ER 15,分子量存在差异911。ER为含595个氨基酸的蛋白质,分子量67kD 7,ER由485个氨基酸构成,分子量54kD 12,但也有报道分子量为63kD

17、13。最新研究发现ER与ER 在肿瘤细胞中的分布和相对表达水平不同,其作用存在差异,临床意义也不同8,11。1983年,Horwitz 等发现PR 有两种亚型PR 2A (单体和PR 2B (三体,A 型PR 的分子量为81kD ,B 型PR 的分子量为116kD 14,15。进一步研究乳腺癌细胞中ER 和PR 各亚型的表达情况及其关系,以及分布情况,对研究激素作用机制,探讨乳腺癌的内分泌治疗具有意义。流式细胞术(FCM 是ER 、PR 定量检测的重要手段,但FCM 方法难以反映蛋白质分子量的大小和肽链的完整性等,而Western blot 作为蛋白质分析的经典手段恰好可以弥补FCM 检测时的

18、不足。此外,通过分离乳腺癌细胞的胞质和胞核,Western blot 方法还可对受体在细胞内的分布及表达情况进行检测。为提高Western blot 检测方法的准确性,我们采用肌动蛋白(Actin 作为不同样本蛋白质点样量的监测指标。已知所有真核细胞均表达Actin ,且表达恒定,约占细胞总蛋白的406华中科技大学学报(医学版2004年10月第33卷第5期50%16,17。本研究用Santa Cruz公司的抗人类肌动蛋白单克隆抗体Actin(C22与不同乳腺癌细胞株电转印后的ECL膜反应,蛋白印迹条带密度基本一致,说明不同样本的点样量基本相同,有利于比较不同样本的受体表达水平。乳腺癌细胞株T2

19、47d、MCF27和ZR27521 Western blot检测ER阳性,其中以ZR27521表达最强,其他细胞株ER为阴性;PgR636是一种针对PR2AB的单克隆抗体,Western blot检测时T2 47d和ZR27521细胞株PR阳性,其中T247d细胞PR表达较强,且存在3种不同分子量大小的条带,其他细胞株PR表达阴性。不同细胞株ER、PR表达情况的Western blot检测结果与FCM检测结果说明,Western blot检测ER、PR的方法是可行的。参考文献1Mc Guire W L.Hormone receptors:their role in predicting pro

20、gnosis and response to endocrine therapy.Semin On2 col,1978,12:3172Toniolo P G,Levitz M,Zeleniuch2Jacquotte A et al.A prospective study of endogenous estrogens and breast can2 cer in postmenopausal women.J Natl Cancer Inst,1995,87:1903K lijn J G,Berns E M,Foekens J A.Prognostic factors and response

21、to therapy in breast cancer.Cancer Surv,1993,18:165社,1995.8898915Sabe I,Andritsch I,Mangoud A et al.Flow cytometric analysis of estrogen receptor expression in isolated nucleiand cells from mammary cancer tissues.Cytometry,1999,36:1317Greene G L,G ilna P,Waterfiled M et al.Sequence and expression of

22、 human estrogen receptor complementaryDNA.Science,1986,231:11508Mosselman S,Polman J,Dijkema R.ER:identification and characterization of a novel human estrogen receptor.FEBS Letter,1996,392:499Pfeffer U,Fecarotta E,Castagnetta L et al.Estrogen re2 ceptor messenger RNA lacking exon4in estrogen respon

23、2 sive human breast cancer cell lines.Cancer Res,1993, 53:74110Moore J T,Mc K ee D D,Slentz2K esler K et al.Cloning and characterization of human estrogen receptor beta iso2 forms.Biochem Biophys Res Commun,1998,247:75 11Vladusic E A,Hornby A E,Guerra2Vladusic F K et al.Expression of estrogen recept

24、ormRNA variant in breast cancer.Cancer Res,1998,58:21012Enmark E,Pelto Huikko M,Grandien K et al.Human estrogen receptorgene structure,chromosomal localiza2 tion,and expression pattern.J Clin Endocrinol Metab, 1997,82:425813Bhat R A,Harnish D C,Stevis P E et al.A novel human estrogen receptor beta:identification and functional analy2 sis of additional N2terminal amino acids.J Steroid Biochem Mol B