2,4,6-三氯苯胺暴露下鲫鱼生物标志物的研究

1、2,4,6-三氯苯胺暴露下鲫鱼生物标志物的研究陈涛 唐旭河海大学环境科学与工程院，江苏 南京 (210098)Email: dolphin摘要：研究了2,4,6-三氯苯胺暴露对鲫鱼( Carassius auratus) 的几种生物标志物的影响。在鲫鱼接受5个不同浓度的2,4,6-三氯苯胺的腹腔注射10 d 后，分析了其肝脏7-乙氧基-3-异吩唑酮- 脱乙基酶(EROD)和谷胱甘肽还原酶（GST）活性，以及脑中乙酰胆碱酯酶（AChE）活性变化。结果显示: 2,4,6-三氯苯胺可使鱼肝脏中EROD 和GST活性显著诱导，并且随着2,4,6-三氯苯胺浓度的增加，酶活性呈正相关上升，而鱼脑的AChE

2、活性没有明显的变化。因此,鲫鱼EROD、GST酶活性的改变适于作为生物标志物,可以用来显示暴露于2,4,6-三氯苯胺有机污染物鱼类的生活状态。关键词：2,4,6-三氯苯胺，生物标志物、EROD、GST、AChE中图分类号：X830.21 引言近来越来越多的有机污染物以各种形式进入环境，使水体受到污染。外源化学物的低水平、长期、慢性接触，将是新世纪各种环境污染物对人体影响的基本方式。而传统的检测方法和技术所采用的各种指标阐明的是后期效应，缺乏预警价值。因此，生物标志物成为目前生态毒理学领域研究的热点1。2,4,6-三氯苯胺是偶氮染料、杀虫剂、杀菌剂、除草剂等的中间体，在照相工业中作为碱性品红的偶

3、联剂，具有广泛的用途2。此类化合物毒性大、难降解并易于生物富集，可以通过吸入、食入或透过皮肤吸收而导致中毒，通过形成高铁血红蛋白造成人体血液循环系统损害，具有致癌、致畸、致突变效应，对鱼类、哺乳动物以及人类的潜在危害已引起极大关注。P450酶系作为毒物毒性的生物学标志物已广泛应用于毒理学研究3,4，其中肝细胞色素P450酶系的诱导已被提出作为评价环境污染状况最灵敏的生物学反应之一。目前以P450作为毒理学指标的生物检测主要是对体内7-乙氧基-3-异吩唑酮- 脱乙基酶(ethoxyres-orufin-O- deethylase，EROD)活性测试5。谷胱甘肽还原酶(glutathione tr

4、ansferase，GST)作为细胞内主要的期解毒酶，参与很多污染物生物转化的过程，这种酶具有广泛的作用底物，可能受暴露下的金属、PAHs、有机氯和有机磷杀虫剂的抑制6，可作为水环境污染的生化标记。乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase，AChE)作为环境生物标志物应用广泛，已有许多工作者研究了以AChE作为敏感酶，制成相应的酶传感器来检测环境中的有机磷农药7。文中选择鲫鱼(Carassius auratus)作为受试生物体。鲫鱼为我国重要食用鱼类之一，在生态系统食物链起重要作用，并且地理分布广泛，是一种适宜的受试物种。2 材料与方法2.1仪器与试剂酶标仪(M0lecular

5、Device VersaMax, USA)，高速冷冻离心机(Anke TGL-16G-A, 上海安亭科学仪器厂)，高速匀浆机(FSH-2，浙江金华市荣华仪器制造有限公司)；2,4,6-三氯苯胺(上海化学试剂有限公司，分析纯)。2.2 材料与染毒条件试验用鲫鱼,平均体长为12cm左右,平均体重为50g。试验前经筛选并在水族箱中驯养一周以上,自然死亡率低于1%。试验用水为曝气3d后除氯的自来水。试验前1d开始禁食。将2,4,6-三氯苯胺溶于二甲亚枫(DMSO)，按照0.1、1、5、10、20mg/kg的剂量，进行腹腔注射200l，对照组注射相同体积的DMSO，10d后将鱼体解剖，取出肝脏和脑。2.

6、3取样和样品预处理 预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏和脑，操作均在4下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。将肝组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-Hcl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆，头组织放入预冷的磷酸缓冲液(0.1 mol/L, 含1% Triton X-100, pH 8.0)条件下匀浆，匀浆速率为10000r/min，以15s为周期，重复3次。分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4下离心，肝组织离心15min(9000r/min)，脑组织离心20min，取上清

7、液-80下保存，待测。2.4 酶活性的测定2.4.1 GST活性的测定GST活性的测定根据Habig方法稍加改进8。将0.1mmol/L 磷酸缓冲液(pH为6.5)100l，1.0 mmol/L 1-氯-2,4-二硝苯基(CDNB)10l，1.0 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)10L和880l超纯水混匀后组成反应体系。取96孔的酶标板，每孔加170l反应体系和10l粗酶液(对照用H2O代替GSH)，波长340nm下立即读数，20s为周期连续读数2min。每个待测样品做3个平行。反应产物2,4-二硝基苯-谷胱甘肽的E340 =9.6/mmol/L/cm。GST活性定义为每毫克蛋白质，每分钟

8、扣除非酶促反应，使GSH浓度降低1 mol/L为一个酶活力单位(nmol/min/mg pro)。2.4.2 EROD活性的测定取96孔酶标板，每孔加140l 100mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)，40l 2.5 mmol/L NADPH，10l 40mol/L 7-乙氧基异吩唑酮和10l粗酶液加入96孔酶标板中，对照以H2O取代NADPH，25保温30分钟，用酶标仪在572nm下测吸光值9，反应产物异吩唑酮的E572=73/mmol/L/cm 。 2.4.3 AChE活性的测定AchE活性的测定根据Ellman等的方法稍加改进10。取96孔酶标板，每孔按次序分别加入195l 8

9、mmol/L 5,5-二硫双基-2-硝基苯甲酸(DTNB)，5l 酶液和20l 20mmol/L碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）。每个待测样品3个平行。温度30，波长405nm下立即读数，20s为周期连续读数2min。E405=13.6/mmol/L/cm.2.4.4 蛋白质含量的测定蛋白质含量测定采用Bradford的方法11稍加改进。取各样品液10l，以3个重复分别加入酶标板孔中，加入200l蛋白试剂(称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%(W/V)磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml)充分震荡，静置10min后于测定595nm下读数(空白用H2O代替

10、)。用相同方法，以标准牛血清蛋白(BSA)绘制成蛋白质含量标准曲线。查标准曲线得出待测样品的蛋白质含量。2.5 实验数据处理与分析用SPSS处理数据，并进行平均数和方差的分析。3 结果3.1鲫鱼肝脏的GST活性的变化图1 2,4,6-三氯苯胺对鲫鱼肝脏GST活性的影响注射10天后，鲫鱼肝脏GST活性的变化如图1。与空白样对比，溶剂对照组与空白组鲫鱼肝脏GST活性值基本持平，这表明所用的溶剂对鲫鱼体内GST活性没有影响。由图中可看到低浓度组(0.1mg/kg)鲫鱼肝脏GST活性已经开始被诱导，诱导率为19%，并且随着化合物浓度的升高，诱导率逐渐增大，分别为41%、47%、64%，实验中最大剂量2

11、0mg/kg时，GST活性诱导率达到最大为87%，可见随着浓度的升高GST活性诱导率稳定增长。3.2鲫鱼肝脏的EROD活性的变化图2 2,4,6-三氯苯胺对鲫鱼肝脏EROD活性的影响鲫鱼肝脏EROD活性的变化如图2。从图中我们可以看到，肝脏中的EROD活性在低浓度(0.1mg/kg和1mg/kg)时变化不明显，但可看出1mg/kg时EROD活性是被诱导的。随着化合物浓度的升高，EROD活性被明显诱导，在20mg/kg剂量条件下酶活性诱导率达到108%，且有明显的剂量效应关系，随着剂量的增加，EROD活性呈明显的正相关上升。3.3鲫鱼脑中AChE活性的变化图3 2,4,6-三氯苯胺对鲫鱼脑ACh

12、E活性的影响鲫鱼脑AChE活性活性的变化如图3。低浓度(0.1mg/kg)暴露时AChE变化不明显，1 mg/kg时出现轻微的抑制，但AChE活性总体变化趋势不明显，实验的浓度中，AChE抑制率最大5mg/kg暴露浓度，抑制率只有12%。由图可见，鲫鱼脑组织中的AChE活性变化不明显。4 讨论细胞色素P450依赖的混合功能氧化酶的一个重要特征是解毒反应酶可通过暴露而诱导,且在不同底物诱导下显示出不同的酶活性，其中EROD活性的诱导已成为PAHs 和多氯联苯(PCBs) 等有机物存在的生物标志物12。EROD依赖于细胞色素P450，存在于细胞膜上，有人认为EROD的活性越大，污染物潜在的毒性和致

13、癌危险性越高13，EROD的激活可以作为某污染物致毒效应的重要标志 14。本实验的研究结果也显示，各浓度的2,4,6-三氯苯胺在暴露10d后，EROD活性受到明显的诱导，这可能是由于2,4,6-三氯苯胺弥散进入肝细胞内并与细胞内的载体蛋白结合，然后进入细胞核内影响DNA，刺激mRNA的转录，从而使粗面内质网CYP450增强15。并且在高浓度(20mg/kg)时诱导明显，诱导率达到108%，说明2,4,6-三氯苯胺在鲫鱼肝脏大量积累引起EROD活性的升高，也说明鲫鱼体肝脏内的EROD对2,4,6-三氯苯胺的反应敏感，随着暴露浓度的增加而增加。实验结果表明，EROD能够很好的检测环境中三氯苯胺污染

14、物的影响。GST是参与药物代谢的一种重要酶类，是生物体内广泛存在的一类催化谷胱甘肽与多种疏水性化合物的亲电子基团相连接的胞质酶，其功能可消除体内自由基和解毒双重功能16。研究表明，2,4,6-三氯苯胺对鲫鱼肝脏GST活性作用较为明显，表现为对GST酶活性明显的诱导作用。GST活性的升高是鲫鱼对外源污染物的一种应激反应机制，即可能是过量的2,4,6-三氯苯胺进入生物体后生成超氧阴离子(O2-·)，进而产生大量的活性氧(ROS)，使细胞内的氧化还原平衡发生改变，诱导一系列的氧化胁迫的应激反应。并且通过提高组织中的GST活力以强化GSH与毒物的结合能力，能够催化GSH解毒，GST活力在不同

15、浓度2,4,6-三氯苯胺下都表现出不同的激活作用，并且随着暴露浓度的增加，诱导率增加，暴露浓度和诱导率之间正相关。肝脏GST参与很多污染物生物转化的过程，因此GST活性诱导被广泛应用于环境生物标志物。实验结果也表明，GST活力反映了毒物对于鲫鱼肝脏的致毒程度，是一个合适的评价有机物毒性的指标。乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物神经传导中的一种关键水解酶，维持体内胆碱能神经冲动在神经传导中起着关键作用17。胆碱酯酶是神经毒性物质如有机磷农药和氨基甲酸酯农药的敏感指标18，主要参与突触的信息传递，目前已被广泛用作有机磷农药极性接触的效应生物标志物。在测定浓度下未发现2,4,6-三氯苯胺对AChE有明显

16、效应，高浓度时虽存在轻微的抑制(5mg/kg 暴露时，抑制率为12%)，但程度不明显，说明鲫鱼脑组织中的AChE对2,4,6-三氯苯胺的反应不是很敏感。造成这一现象的原因可能是由于鱼体内的免疫酶受外界刺激，分泌量增多，从而保护了脑组织内AChE的分泌功能。另外，有实验指出，污染物浓度、暴露方式、暴露时间、测试的生物个体差异等都会对酶活性产生影响20。M. Monteiro等研究了3,4-二氯苯胺对虾虎鱼的AChE活性的影响，结果也未发现AChE有明显的效应19，这与本实验的研究结果是一致的。实验结果显示，鲫鱼脑组织中的AChE对2,4,6-三氯苯胺不敏感，AChE是否可以作为鲫鱼对2,4,6-

17、三氯苯胺的响应的指标还需要进一步的研究予以说明。5 结论实验结果表明，生物转化中的EROD 活性的大幅度升高和GST活性的显著被诱导，都能够反映生物体的被致毒的状态，所以鲫鱼EROD和GST适于作为生物标志物，可通过测定这两种酶在污染物影响下的活性变化，来评价污染物的毒性和生物体的受伤害程度。而鲫鱼脑组织中的AChE变化不明显，是否可以作为2,4,6-三氯苯胺污染的生物标志物指标还需要进一步的研究。参考文献1Van der oost R, Beterj ,Vermeulen N P E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental

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