灰树花多糖对禽流感灭活疫苗预防效果的影响.docx

1、DOI：10.15955/j.issnlOOO-3924.2015.03.14上海农业学报2015,31(3):68-72ActaAgriculturaeShanghai文章编号:1000-3924(2015)03-068-05灰树花多糖对禽流感灭活疫苗预防效果的影响丁海城周昌艳小，刘承初"('上海海洋大学食品学院，上海201306；2h海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201304；上海水产品加工保藏工程研究中心，上海201306)摘要：将正常的清洁级北京油鸡分组饲喂添加不同百分比灰树花多糖的饲料，分别在10日龄、25日龄和40日龄时注射禽流感H5N1灭活疫

2、苗免疫，并在注射免疫的第2天进行血液中禽流感病毒H5亚型抗体(AIV-H5Ab)水平、巨噬细胞吞噬活性和T淋巴细胞亚群(CD3收稿日期：2014-05-14基金项目：上海市科技兴农项目沪农科攻字(2012)第2.7号;国家食用菌质量安全风险评估专项GJFP2015006作者简介:丁海城(1989)，男，在读硕士，主要从事糖生物学研究。E-mail:ding_haicheng通信作者,E-mail:changyanz/CD4*/CD8*)含量的测定，统计饲养过程中的饲料消耗以及油鸡体重的增加量,计算不同分组的生产性能。试验结果表明:灰树花组分能提高AIV.H5Ab的水平，增强吞噬细胞的活性，增加

3、T淋巴细胞亚群的含量，提高北京油鸡的生产性能，对AIV-H5亚型灭活疫苗的预防效果具有良好的促进作用。关键词：灰树花多糖;北京油鸡;禽流感病毒;AIV-H5亚型;灭活疫苗;预防效果InfluenceofGrifolafrondosapolysaccharideonpreventiveeffectofavianinfluenzainactivatedvaccineDINGHai-cheng1,ZHOUChang-yan2*,LIUCheng-chui,3(1CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai2013

4、06,。死似；2InstituteforAgro-FoodQualityStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China；ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquaticProductProcessing&Preservation,Shanghai201306,China)Abstract:CleanPekingyellowchickensweredividedintogroupsandraisedwiththefeedsc

5、ontainingdifferentpercentagesofGrifolafrondosapolysaccharide;theywereinoculatedwithavianinfluenzavirusH5N1inactivatedvaccinerespectivelyatagesof10,25and40days,andtheirsera'sAIV-H5Ablevels,macrophages*activitiesandT-cellsubpopulations(CD3*/CD4*/CD8+)weredeterminedonthenextdayafterinoculations；and

6、thedifferentgroups'feedconsumptions,bodyweightgainsandproductionperformanceswereanalyzed.TheresultsindicatedthattheG.frondosacomponentscouldraisetheAIV-H5Ablevel,enhancethemacrophages*activity,increasetheT-cellsubpopulations,improvetheproductionperfonnance,andinshort,promotethepreventiveeffectof

7、A1V-H5N1inactivatedvaccine.Keywords：Grifolafrondosapolysaccharide；Pekingyellowchicken；Avianinfluenzavirus；A1V-H5N1；Inactivatedvaccine；Preventiveeffect灰树花(Grifolafrondosa)又名贝叶多孔菌、粟蘑，俗称云蕈、日本称舞茸，属于担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属，是一种新型的药、食兼用的珍稀食用菌属。现代医学研究表明，作为灰树花中主要活性成分的灰树花多糖具有显著的抗癌、保肝、降血压、提高免疫力等诸多药理学活性。禽流感(Aviani

8、nfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种接触性传染病，严重威胁着世界各地的家禽业，特别是由H5、H7亚型病毒引起的高致病性禽流感，给家禽业造成了巨大的经济损失，不仅如此，1997年发现的H5N1和2013年发现的H7N9亚型高致病性禽流感病毒能直接感染人，并导致死亡，对人类的身心健康造成严重危害，引起了全世界的高度关注2勿。为了能够有效预防和快速控制高致病性禽流感疫情,许多国家和地区采取了扑杀、强制性免疫和生物安全相结合的防治措施，取得了良好的效果，世界卫生组织专业也建议将免疫接种作为扑杀的补充手段。本研究将灰树花多糖作为北京油鸡的饲料添加剂来试验灰树花多糖对H5N1亚型灭活疫苗效果

9、的影响，以期为新型动物饲料添加剂的开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物1日龄清洁级雄性北京油鸡300羽，健康状况良好，由上海市农业科学院庄行养殖基地提供并饲养。饲养至1周龄时随机分为5组，每组60只分笼饲养。1.2试验样品60目灰树花粉，灰树花子实体原材料经上海百信生物科技有限公司药用粉碎机粉碎并过60目筛，经过测定其中多糖含量为8.49%。重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(ReG株+Rel株)，由哈药集团生物疫苗有限公司提供。1.3试验方法供试鸡在分组前均饲喂相同的常规全价饲料,1周龄时分组饲养，第1组饲喂含有1%灰树花多糖组分的饲料，第2组饲喂含有0.5%灰树花多糖的饲料，第3组

10、饲喂含有0.25%灰树花多糖的饲料，第4组和第5组饲喂常规全价饲料。10日龄时首免，对第1组、第2组、第3组、第4组注射禽流感油乳剂灭活疫苗0.3mL/羽，第5组作为空白对照组,不注射免疫;25日龄时二免,0.3mL/羽;40日龄三免,0.5mL/羽。1.4鸡禽流感病毒H5亚型抗体(AIV-H5Ab)水平测定分别在首免、二免和三免后的第1天每组随机抽取10只,翼下静脉采血,2000r/min离心10min,取血清，用ELISA试剂盒测定其中AIV抗体含量。ELISA试剂盒由上海劲马实验设备有限公司提供，批号：201309o1-5血液中巨噬细胞吞噬活性的测定分别于首免、二免和三免后的第1天每组随

11、机取10只鸡,侧翅酒精消毒，按照体重以2mL/kg将印度min时和10min时从对侧翅下静脉取汁:生理盐水(1：3)侧翅静脉注射,注射完毕立即计时,分别在2血20以，加入到含有2mL0.1%Na2CO3的溶液中，摇匀，以0.1%Na2CO3溶液做空白对照在600nm波长下测定OD值。然后将鸡处死，取肝脏、脾脏，吸水纸吸净表面水分，称重，根据得到的数据计算吞噬指数a：_lgO2-蛆。】0_tt2°K为未经校正的吞噬指数;。2为2时血液样品的OD值;。久为时血液样品的OD值;吞噬指数:吞噬指数:体重肝重+脾重1.6鸡T淋巴细胞亚群(CD3+/CD4*/CD8+)含量测定分别在首免、二免和

12、三免后的第1天每组随机抽取10只,翼下静脉采血,2000r/min离心10min分离血清，用ELISA试剂盒测定血清中T淋巴细胞亚群(CD3/CD4+/CD8*)含量。ELISA试剂盒由卡迈舒(上海)生物科技有限公司提供，检测范围15.6-500.0pg/mL,批号：2013/07/26(96T)o1.7生产性能的测定分组饲喂之后，对每次免疫期间的饲料消耗量及供试鸡体重进行称量统计，根据每组饲料消耗量以及增加的体重进行生产性能的评估。数据分析及处理所得数据由Excel2010及SPSS13.0进行分析处理，以Mean土SE表示。1.82结果与分析2.1鸡禽流感病毒H5亚型抗体(AIV-H5Ab

13、)水平按照ELISA试剂盒的操作要求,对采集的血清样品中H5亚型抗体(AIV-H5Ab)的含量进行测定，结果如表1所示。根据所得的数据，首免后空白组的抗体量为(226.82±8.66)ng/L,超出了正常范围且与其他免疫组差异不明显，表明油鸡在生长初期体内就已经含有少量的AIV-H5Ab抗体，具备一定的抗病毒能力。根据王志平的报道，可以判断母体将一定的免疫能力传递给子代，使得子代在孵化成长之后就具有一定的抵抗H5N1病毒的能力。二免之后抗体含量较之前有所增加，增幅在21.07%T2.76%,三免后的抗体含量较二免增幅在11-08%33.47%，可以看出增幅明显减缓，表明体液免疫趋于平

14、稳。通过同批次的试验结果可以看出，添加了灰树花多糖的组较未添加的抗体量分别高0.80%-14.79%、26.36%-37.92%，其中二免后的第1、2组较其他几组差异性显著(P<0.05),三免后的第1、2、3组较其他组差异性显著(P<0.05)，说明灰树花组分的添加对提高血清中H5亚型抗体量起到了促进作用。表1血清样品含禽流感病毒H5亚型抗体Table1ContentsofAIV-H5Abinserumsamples组别12345首免220.81 ±7.91a225.39±7.19a236.56±3.91a223.66±4.46a226.8

15、2 ±8.66a二免315.23±7.25a291.56±10.68ab279.72±7.28b276.82±9.73b274.61±8.91b三免420.74±17.83a410.11±14.07a397.15±21.36ab385.46±18.68b305.05±15.95b注洞列不同字母代表差异显著(P<0.05)；H5亚型抗体含量在23.5-141.2ng/L为正常值。2.2血液中巨噬细胞的吞噬活性经过对采集到的样品进行处理及测定，得到的相关数据经过计算，得到每个样品组在

16、免疫注射后代表巨噬细胞吞噬性能的吞噬指数a(表2)。表2不同日龄北京油鸡的吞噬指数aTable2Phagocyticindexes(a)ofPekingyellowchickensatagesindays组别10日龄25日龄40日龄18.16±0.96a9.81±2.73ab12.01±1.78c27.81±0.94a9.37土1.36ab11.59±2.12c37.34±1.97a9.51±2.26ab10.82±2.32b47.30±1.79a8.39±2.05a10.26±2.0

17、8ab58.02±1.08a9.79±1.36ab9.98±2.27a注:同列不同字母代表差异显著(P<0.05)。表2可见,相同试验组随着饲养周期的延长吞噬指数a逐渐增大，其中注射疫苗且在饲料中添加灰树花组分的第1、2、3组平均增长幅度为21.62%,阳性对照组平均增长幅度为18.60%，而阴性对照组的平均增幅为12.01%。由此可知，北京油鸡的免疫能力随着生长周期的延长而增强，同时也表明疫苗注射在一定程度上促进免疫系统的发育。同日龄的不同实验组间比较可知，除10日龄外,25日龄和40日龄组中添加了灰树花组分的组的吞噬指数分别较阳性对照组高13.35%16

18、.90%和5.45%17.06%，具有显著性差异(户<0.05),且总体上吞噬指数与灰树花组分的添加量呈正相关，故认为灰树花组分对吞噬指数的提高起到了促进作用，即对免疫系统的发育起到了一定的促进作用。2.3鸡T淋巴细胞亚群(CD3+/CD4+/CD8+)的含置按照ELISA试剂盒的操作要求,对采集的血清样品中T淋巴细胞亚群(CD3+/CD4+/CD8+)含量进行测定，结果见表3。表3不同日龄北京油鸡T淋巴细胞亚群(CD3/CD4+/CD8+)含置注:同列不同字母代表差异显著(P<0.05)。Table3T-cellsubpopulations(CD3+/CD4+/CD8+)cont

19、entsofPekingyellowchickensatagesindayspg*mL,组别10日龄25a龄40日龄1189.982±14.452ab386.673±31.721a421.546±36.527ab2180.603±22.066a377.676±28.667a418.748±31.622a3179.213±18.570a342.358±31.721a390.691±39.301a4166.372±13.551a375.726±37.766a396.565±40.

20、018ab5201.554±12.744ab394.281±35.338a457.345±33.323b根据试验结果，相同试验组的T淋巴细胞亚群含量随着时间的推移而逐渐增高，但前2次采样间隔增加比例(89.56%125.83%)比后两次间隔(3.45%22.31%)差异较大,根据孙国庆等的研究可推测:在25日龄到40日龄期间的T淋巴细胞含量变化较小，增长幅度变缓。针对不同日龄的组间比较可知：阴性对照组的T淋巴细胞含量较注射过AIV疫苗的组要高，增幅为15.17%-18.03%,在一定程度上反应了AIV疫苗对T细胞免疫功能的抑制，与郑世民等、罗玲等的研究一致。饲料中

21、添加了灰树花的第1、2、3组相比于阳性对照组,除添加量为0.25%的第3组组含量较低之外,其余两组均高于阳性对照组,但不具有显著性差异(F>0.05),说明添加的灰树花组分在一定范围内对北京油鸡的细胞免疫系统有促进作用。根据罗燕等的研究，推断应为含有的灰树花多糖对淋巴细胞转化率起到了一定的促进作用，增强了机体的细胞免疫功能。2.4生产性能根据对北京油鸡分组饲养后的饲料日消耗量以及体重的记录，对每次免疫注射之间的相关数据进行整理，得到了北京油鸡在不同时间段内的增加体重及饲料消耗量。根据表4,所有试验组在710日龄期间的料重比较1125日龄和710日龄的料重比分别高0.13%3.70%和2.

22、56%T.06%,说明北京油鸡在后期的生长过程中对饲料的利用率较高，也有可能是因为前期因北京油鸡体型较小而采用托盘给料造成了一定的饲料浪费导致，故后期数据较前期数据更具有说服力。对比同阶段不同分组的数据可知，阴性对照组的体重增加量比注射过AIV疫苗的其余4组都要高，反应出疫苗在一定程度上会影响鸡自身的生长发育,这可能与其在免疫功能上的增强来对疫苗产生免疫特性有关。26T0日龄期间，第1、2、3组的料重比分别较阳性对照组和阴性对照组平均低1.08%和0.49%，说明饲料中添加的灰树花组分对饲料的利用率有一定的促进作用,即灰树花组分对提高料重比起到了促进的作用，但效果较小。表4不同时间段内北京油鸡

23、的体重增加、饲料消耗以及料重比Table4Pekingyellowchickens'bodyweightgains,feedconsumptionsandratiosoffeedtoweightgainatgrowthstages组别710日龄H25日龄26-40日龄体重增加量/g饲料消耗量/g料重比体重增加量底饲料消耗量/g料重比体重增加量/g饲料消耗量/g料重比117.9068.643.835112.70418.823.716201.4736.963.659218.3069.853.817110.90418.543.774199.7733.103.671318.1871.323.9

24、22111.42421.393.782203.4752.173.698418.5170.563.811110.55420.773.806198.6738.113.716518.8772.113.821113.39422.713.728205.1757.643.6943结论与讨论体液免疫是由B淋巴细胞介导的一种重要的特异性免疫反应，是机体抵抗传染病的主霎因素之一。作为衡量禽类体液免疫功能的重要标志之一,外周血液中的抗体在机体内可以发挥多种免疫功能。本实验结果表明灰树花多糖能有效提高机体内H5亚型抗体的含量，并且H5亚型抗体含量与饲料中添加的灰树花多糖含量成正比,说明灰树花多糖对重组禽流感病毒H5

25、亚型二价灭活疫苗诱导的特异性免疫具有显著地增强作用。巨噬细胞是动物机体天然抵抗力的一个重要组成部分，也是非特异性免疫不可或缺的成分,具有吞噬杀伤、抗原呈递和合成分泌各种活性因子的功能，对机体的体液免疫和细胞免疫均有着非常重要的作用"°。因此，测定机体巨噬细胞的功能活性对研究机体的非特异性免疫功能具有非常重要的意义，试验结果表明，巨噬细胞吞噬指数与添加的灰树花含量呈正比且随着饲养周期的延长而逐步升高，说明灰树花多糖能有效的增强巨噬细胞的吞噬活性。CD3、CD4与CD8分子是T细胞重要的表面标志，其中CD3在未成熟胸腺细胞中就能被检测到，是作为T细胞系发挥作用的最早信号,CD4

26、和CD8是绝大部分胸腺细胞表面都表达的分子。CD3分子是由多种跨膜蛋白组成的复合蛋白，在抗原的识别过程中起着传递信号的作用,CD4和CD8分子作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别，其中CD4*T细胞能识别MHCII类分子递呈的抗原，而CD8+T细胞能识别MHCI类分子呈递的抗原皿心。实验结果表明灰树花多糖能有效的提高血液中T淋巴细胞亚群(CD3'/CD4+/CD8+的含量)，对机体的细胞免疫功能具有较强的增强作用。生产性能是衡量饲料利用率的指标之一，同时也是判断一个动物品种优良与否的重要指标。试验数据表明灰树花多糖能提高油鸡的生产性能，且在生长后期的增长率比生长前期高。注射

27、了重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗的分组生长性能较阴性对照组低，也说明禽流感疫苗引起的一系列免疫反应对机体的正常生长造成了一些影响,与此前鲁梅等对肉鸡的相关研究有悖,推测可能的原因是疫苗的种类不同及实验对象不同导致。综上所述,在饲料中添加一定量的灰树花组分，一定程度上会增强鸡的巨噬细胞的吞噬能力，刺激淋巴细胞的增殖分化，通过抗体补体的作用使中性粒细胞的吞噬能力进一步加强。T淋巴细胞亚群的含量与添加的灰树花组分成正相关，也表明灰树花组分对促进免疫系统的发育,增强机体的免疫抗性有良好的促进作用，但同时也发现疫苗在一定程度上会影响北京油鸡的体重增长，这可能与其需要将部分营养物质与能量分配给免疫系统进行发育而有关。而且少量的灰树花组分会提高饲料的利用率，促进机体在特异性免疫反应的同时对饲料有良好的吸收利用效率。所以，一定量的灰树花组分可以促进机体非特异性免疫的反应强度，增强抵抗力，同时对生产性能的提高也有较好的促进作用。参考文献1刘安,臧立华，孙庆济,灰树花多糖抗肿瘤作用的临床观察J.山东轻工业学院学报,2008,22(2):4345.2JSuarezDL,Perdueml,CoxN,etal.ComparisonsofhighlyvirulentH5N1influenzaAvirusesisolat