嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

1、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究         11-04-03 11:43:00     编辑：studa20                作者：傅佳峰，叶盛，朱丹化，曾博，张宇，诸葛启钏【摘要】  目的: 嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后，观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴

2、壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞，制作38只大鼠脑出血模型，分三组：第1组10只为空白组，第2组10只为HBSS移植组，第3组18只为嗅鞘细胞移植组；三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分，判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果，均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活；对三组大鼠进行评分，嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞，并用于细胞移植，移植细胞能存活；嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。 【关键词】  嗅鞘细胞；脑出血；模

3、型，动物；细胞移植    Abstract:  Objective: To transplant the successfully cultured olfactory ensheathing cells to rat cerebral hemorrhage mode and to observe the neurological repair function of OECs and the shape of cells in hematoma and brain tissue of 30 days. Methods: High  purif

4、ication of olfactory ensheathing cells  using the method of the differing rates in attachment of the various cells type was cultured. Thirty-eight rats of cerebral hemorrhage mode were established and divided into 3 groups ；the first group (10 rats) was the blank group ；the second group (10 rat

5、s) the HBSS transplanting group；the third group (18 rats) the OECs transplanting group. The three groups were all scored in 3 days，7 days， 14 days and 30 days after operation by forelimb placing method. The contribution of OECs transplanton for curing rat cerebral hemorrhage with statistics method w

6、as eraluated. Results: OECs were comfirmed alive by immunofluorescence frace method and electron microscope；after scoring the three groups by forelimb placing method and calculating them， Olfactory ensheathing cells injected significantly reduced motor deficits compared with the control groups after

7、 cerebral hemorrhage (P <0.05). Conclusion: OECs can be successfully cultrued using the method of the differing rates of attachment of the various cells type from adult mouse olfactory mucosa and can be used for cell transplanting ；OECs transplanting method is a method of curing rat cerebral hemo

8、rrhage.    Key words:  olfactory ensheathing cells；cerebral hemorrhage；modes；animal；cell transplantation    脑出血疾病在我国是一种危害人民健康的疾病，在脑血管疾病中当属最严重的一种，虽然其发病率只占其中的20%左右，但其病残、死亡率都很高，是老年人死亡的首要原因1。神经干细胞方面研究取得的成功，使神经干细胞移植治疗脑出血成为了研究热点，但神经干细胞也有其自身的缺点，比如，取材困难，存在伦理方面的问题，因此，有一种新的细

9、胞引起了人们的注意，这就是嗅鞘细胞，嗅鞘细胞不仅有神经干细胞的特点，还有其自身的优点，如取材方便，从嗅黏膜即可获得嗅鞘细胞，能够避免伦理问题。笔者尝试用嗅鞘细胞移植来治疗大鼠脑出血，希望能为下一步的临床研究积累经验。    1  材料和方法    1.1  材料  雌性SD大鼠（250300 g，由温州医学院动物实验中心提供），DME/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、VI型胶原酶、HBSS液、P75 NGFR、GFAP、FITC标记的羊抗小鼠IgG、hoechst均由GIBCO公司提供，LEICA解剖显

10、微镜，LEICA倒置相差显微镜，水平离心机为beckman公司的Avanti J-20 XP，荧光显微镜为Olympus公司产品，大鼠立体定向仪。    1.2  方法    免疫荧光鉴定: P75与hoechst双染。用明视野和相差显微镜观察，随机选取5个视野计数阳性细胞数并计算平均阳性百分率。    在制作大鼠脑出血模型后的第3天，注射麻醉，将其置于立体定向架上。碘伏消毒后，沿中线切开缝合线，暴露颅骨。按照实验分组，第2组在立体定向下引导微量注射器向大鼠脑组织尾状核内匀速注射(10 min)

11、10l HBSS，第3组注射由HBSS悬浮的嗅鞘细胞10l（细胞浓度为4×104/l)，其中4只大鼠的嗅鞘细胞标记Hoechst，注射部位为原手术入口，即前囟右旁3.0 mm，进针深度为6.0 mm，当注射5l左右，将微量注射器提高2.O mm继续注射5l，注射时间上下部位各5 min，再分别上下部位各停针5 min后缓慢拔出注射器，3% H2O2清洗创面缝合头皮后，碘酒消毒伤口。    1.3  统计学处理方法  采用单因素方差分析。    2  结果    2.1  免疫荧光鉴定及纯度计算  免疫荧光鉴定：P75具有特异性，本实验行嗅鞘细胞的P75和hoechst免疫荧光双染。嗅鞘细胞根据形态分为梭形细胞、双极细胞、三极细胞、多极细胞及连接成网状的细胞（见图1、图2）。    纯度计算：对培养7 d、14 d和21 d的细胞分别进行纯度计算，各个时间的嗅鞘细胞的纯度是不一样的，培养7 d时嗅鞘细胞的纯度最高，可达80%，以后逐渐下降，14 d纯度为70%，21 d细胞纯度仅为50%。文献报道称嗅鞘细胞比例达50%就可以进行细胞移植4，故本实验培养